孫 蓉，楊 敏，羅俊鵬，向 陽(yáng)，田應(yīng)雪，梁 丹，魏 微，張慶海,4

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

黑腹果蠅卵巢因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單使其成為研究生殖細(xì)胞發(fā)育的優(yōu)良模型[1]。卵巢的基本單位是卵巢管[1]，雌性果蠅含有1 對(duì)卵巢，每1 個(gè)卵巢由16～20 個(gè)卵巢管組成[2-3]，每1 個(gè)卵巢管里含有處于不同發(fā)育階段的卵子。當(dāng)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂時(shí)，果蠅卵子發(fā)生開(kāi)始，一個(gè)細(xì)胞繼續(xù)作為干細(xì)胞，另一個(gè)細(xì)胞成為胞囊干細(xì)胞。每個(gè)胞囊干細(xì)胞經(jīng)歷4 次有絲分裂，產(chǎn)生16 個(gè)細(xì)胞簇，由中胚層來(lái)源的濾泡上皮包圍，形成卵室[4]。在4 次有絲分裂期間，不完全胞質(zhì)分裂導(dǎo)致16 個(gè)生殖細(xì)胞通過(guò)一系列細(xì)胞質(zhì)橋或環(huán)管相互連接，細(xì)胞質(zhì)可以通過(guò)細(xì)胞質(zhì)橋或環(huán)管流動(dòng)。在16 個(gè)細(xì)胞中，1 個(gè)發(fā)育成卵母細(xì)胞，其他15 個(gè)充當(dāng)護(hù)衛(wèi)細(xì)胞[5]。通過(guò)14 個(gè)階段的生長(zhǎng)和發(fā)育，產(chǎn)生成熟的卵子。當(dāng)與卵子發(fā)生有關(guān)的某個(gè)基因缺失或過(guò)表達(dá)就可能影響其生殖器發(fā)育，進(jìn)而影響果蠅的生殖能力。

平面細(xì)胞極性(planar cell polarity，PCP)是許多上皮細(xì)胞的重要特征[6-7]，其建立需要核心PCP基因和2 種鈣粘蛋白(Fat 和Dachsous)。Fat 和Dachsous 起初被確定為腫瘤抑制因子[8-9]，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)赑CP 調(diào)節(jié)中起重要作用[10-11]。果蠅卵巢卵室是研究組織伸長(zhǎng)的理想模型[12]，在卵子發(fā)生的初始階段，伸長(zhǎng)的卵泡(即卵室)圍繞它們的前后軸(anterior-posterior，A-P)旋轉(zhuǎn)。當(dāng)卵泡細(xì)胞圍繞其圓周軸遷移時(shí)，它們會(huì)形成1 個(gè)極化的細(xì)胞外基質(zhì)[13]。一般認(rèn)為，纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)和肌動(dòng)蛋白絲的周向排列可提供一種分子緊身衣，它在生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)械地限制卵室的周向擴(kuò)張，從而促進(jìn)卵室A-P 軸的優(yōu)先伸長(zhǎng)。Fat2 是一種與脂肪相關(guān)的鈣粘蛋白。果蠅Fat2 含有1 個(gè)大的細(xì)胞外區(qū)域，其中包含34 個(gè)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)層粘連蛋白A-G 結(jié)構(gòu)域和膜近端區(qū)域中的5 個(gè)EGF 基序[14-15]。

轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)可以獲得基因突變體。Minos轉(zhuǎn)座子最初分離鑒定自Drosophila hydei，屬于Tc1/mariner 家族[16]。課題組前期獲得1 個(gè)Minos轉(zhuǎn)座子[17]隨機(jī)插入的突變品系，對(duì)其生殖能力進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：此純合突變不可育，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變的純合雌蠅也不可育，而純合雄蠅可育；解剖突變體純合雌蠅卵巢發(fā)現(xiàn)處在14 階段的卵室呈球形，背側(cè)肢異常短小。通過(guò)反向PCR 法對(duì)Minos轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)座子插在kug(kugel)外顯子內(nèi)，kug也稱(chēng)為fat2。本研究中的突變體表型與fat2突變表型[18]一致。本研究對(duì)新的fat2突變體進(jìn)行鑒定，以期為研究fat2基因功能提供新的研究材料。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

野生型果蠅品系w1118和y w；MI3266 FRT 3LR/TM6b，Tb(實(shí)驗(yàn)室自建)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果蠅育性檢測(cè)

挑選突變品系純合雄性果蠅和純合雌性處女果蠅各10 只進(jìn)行雜交，在培養(yǎng)管上記錄日期并編號(hào)，以野生型果蠅w1118為對(duì)照組，雜交第3～10 天在體視顯微鏡下持續(xù)觀察是否產(chǎn)卵、有無(wú)幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)等情況，拍照并作好記錄。

挑選突變品系純合雌性果蠅10 只，與3 只野生型w1118雄果蠅雜交，檢測(cè)雌蠅是否可育。挑選突變品系純合雄性果蠅10 只，與10 只w1118野生型處女果蠅雜交，檢測(cè)雄蠅是否可育。拍照并記錄。

1.2.2 果蠅卵巢解剖及DAPI 染色觀察

取待解剖的雌性果蠅用CO2在麻醉板上熏暈，用解剖鑷夾取果蠅放至裝有PBS 溶液的解剖皿中，于體視顯微鏡下從果蠅腹部第2 節(jié)處用解剖鑷將外層表皮撕開(kāi)，找到2 個(gè)卵巢并分離其周?chē)M織，用鑷子將卵巢放在裝有PBS 溶液的EP 管內(nèi)。用1 mL 移液槍吸走EP 管中的PBS 緩沖溶液，加入4%多聚甲醛1 mL 固定組織，于搖床上搖20 min；用1 mL 移液槍吸走4%多聚甲醛，向EP 管內(nèi)加0.1% PBST 溶液1 mL 和DAPI 1 μL，于搖床上搖20 min；在體視顯微鏡下將卵巢周?chē)慕M織剝離干凈，用鑷子將卵巢放于載玻片中央，用指甲油封片，保存于4 ℃冰箱。于正置熒光顯微鏡觀察果蠅卵巢的形態(tài)。

1.2.3 果蠅基因組DNA 提取

用裝有研磨珠的1.5 mL EP 管收集5 只果蠅，放入-20 ℃中冷凍約1 h，加入DNA 裂解液200 μL 于組織破碎儀破碎3 min，將果蠅充分研磨成勻漿；70 ℃金屬浴孵育30 min，14 800 r/min離心10 min；取上清液150 μL 到新的EP 管，加入異丙醇150 μL 和3 mol/L 醋酸鈉(pH 5.2) 15 μL，混勻，靜置10 min，14 800 r/min 離心10 min，看到絮狀沉淀后，棄上清液；在EP 管中加入70%乙醇1 mL，14 800 r/min 離心5 min，重復(fù)2 次；棄乙醇溶液，空離心1 min，用移液槍吸掉剩余乙醇，靜置至EP 管中乙醇完全蒸發(fā)后，加入超純無(wú)菌水25 μL 溶解沉淀，完成果蠅基因組DNA 的提取。

1.2.4 果蠅基因組DNA 酶切

取果蠅基因組DNA 8.5 μL，限制性內(nèi)切酶Sau3AI 0.5 μL，10×Buffer 1.0 μL，反應(yīng)體系為10.0 μL。37 ℃于水浴鍋中酶切2 h。

1.2.5 果蠅基因組DNA 酶切產(chǎn)物沉淀

向酶切產(chǎn)物中加入3 mol/L 醋酸鈉1 μL 和無(wú)水乙醇1 mL，混勻，-20 ℃放置30 min；于4 ℃14 800 r/min 離心10 min，棄上清液；加入冰冷的70%乙醇500 μL，4 ℃ 14 800 r/min 離心5 min，棄上清液，晾干；加入ddH2O 25 μL。

1.2.6 果蠅基因組DNA 酶切沉淀產(chǎn)物連接及連接產(chǎn)物沉淀

取果蠅基因組DNA 酶切沉淀產(chǎn)物8.8 μL，T4 DNA Ligase 0.2 μL，10×Buffer 1.0 μL，反應(yīng)體系為10.0 μL，于4 ℃冰箱中連接過(guò)夜。連接沉淀步驟同1.2.5 節(jié)。

1.2.7 反向PCR

反向PCR 是根據(jù)中間的1 段已知序列設(shè)計(jì)引物，分別向外擴(kuò)增兩端的未知序列。本研究利用Minos轉(zhuǎn)座子的反向PCR 引物(F：CAAAAGCAACTAATGTAACGG；R：TTGCTCTTCTTGAGATTAAGGTA)對(duì)所插入位點(diǎn)的兩側(cè)DNA 進(jìn)行反向PCR 擴(kuò)增，從而找到Minos轉(zhuǎn)座子插入位置。

反向PCR 擴(kuò)增體系15.0 μL，包括連接沉淀產(chǎn)物6.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，10×ExTaqBuffer 1.5 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，TaKaRa ExTaq0.1 μL，ddH2O 4.7 μL。反 向PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；于72 ℃后延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。反向PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)后的反向PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于Flybase (http://www.flybase.org/)上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，找到Minos轉(zhuǎn)座子插入位置，并判斷其插入方向和影響的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 MI3266 生殖能力鑒定

如圖1 所示：野生型果蠅w11183 d 時(shí)已有2 齡幼蟲(chóng)出現(xiàn)，5 d 時(shí)已有3 齡幼蟲(chóng)。與野生型w11183和5 d (圖1a、e)相比，MI3266的雌性純合處女果蠅與雄性純合果蠅雜交后第3 天沒(méi)有卵產(chǎn)生，且第5 天也未見(jiàn)卵及幼蟲(chóng)(圖1b、f)，而培養(yǎng)管內(nèi)有菌滋生，說(shuō)明MI3266突變品系是純合不育的；雄性純合MI3266與野生型w1118處女果蠅雜交后，第3 天有卵產(chǎn)生，且第5 天能觀察到食物變稀且有大量卵孵化為幼蟲(chóng)(圖1c、g)，說(shuō)明MI3266突變品系的純合雄蠅是可育的；雌性純合MI3266與野生型w1118雄性果蠅雜交后，第3 天沒(méi)有卵產(chǎn)生，且第5 天未見(jiàn)任何卵及幼蟲(chóng)(圖1d、h)，培養(yǎng)管內(nèi)有菌滋生，說(shuō)明MI3266突變品系的純合雌蠅是不可育的。

如圖2 所示：雜交第7 天，野生型組以及純合突變品系雄蠅與野生型處女果蠅w1118雜交組大部分均處于蛹期；而純合突變品系雄蠅與純合突變品系處女果蠅雜交組以及野生型雄蠅w1118與純合突變品系處女果蠅雜交組均未出現(xiàn)3 齡幼蟲(chóng)和蛹，管內(nèi)食物出現(xiàn)嚴(yán)重的裂開(kāi)現(xiàn)象且有菌滋生，說(shuō)明這2 個(gè)雜交處理無(wú)法產(chǎn)生后代。結(jié)合圖1 和圖2 可知：MI3266突變品系的純合雌蠅不可育，其生殖系統(tǒng)可能存在可見(jiàn)的缺陷。

圖1 雜交第3 和5 天各培養(yǎng)基內(nèi)卵孵化情況Fig.1 The hatching of eggs in culture medium of the 3rd and the 5th day

圖2 雜交第7 天各培養(yǎng)管內(nèi)果蠅生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of each vial on the 7th day of hybridization

2.2 MI3266 卵巢表型檢測(cè)

野生型組w1118的果蠅卵巢結(jié)構(gòu)正常，卵巢管由一串處在不同發(fā)育階段的卵室構(gòu)成，處于14階段的卵室呈橢球型，背側(cè)肢細(xì)長(zhǎng)(圖3a、c)；突變品系組MI3266的卵巢結(jié)構(gòu)形態(tài)異常，處于14階段的卵室呈球型，背側(cè)肢明顯變短(圖3b、d)。

圖3 果蠅卵巢DAPI 染色Fig.3 DAPI staining results of Drosophila ovary

2.3 MI3266 插入基因鑒定

由圖4 可知：與DNA 2000 Marker 相比，突變品系擴(kuò)增條帶大小約為700 bp，水和w1118泳道無(wú)條帶，說(shuō)明擴(kuò)增到MI3266插入基因組的特定條帶。

圖4 電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results

反向PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果為：CCGGGTGGGAGGATGCATTGGTATGTGTTATCTTTAGTAGTATTGATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGCACTGCAAAAAAACATGCTGTTCGAATTAATAGTGGTTGGGGCTCGTATATCCGTCTTGGATGTGAACGACAATTGCCCCTTGTTTGTCAATATGCCCTATTATGCCACAGTCTCTATTGACGATCCAACCCCTTGTGTCATGTCGGCGACCCTACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGCACTACTCCCGAAAACCGCTTCTGACCTGGGAAGCTTCCGTTACATTAGTGCTTTTG。BLAST 結(jié)果顯示：MI3266中的Minos 轉(zhuǎn)座子插入到果蠅三號(hào)染色體左臂20015792 和20015793之間，突變基因?yàn)閒at2，基因編號(hào)為CG7749。結(jié)合反向PCR 引物、BLAST 匹配序列方向與果蠅基因組序列的方向，判斷轉(zhuǎn)座子的插入方向?yàn)?′在右、3′在左，轉(zhuǎn)座子位于匹配片段左側(cè)，方向向左，與fat2基因編碼方向相反，但插入fat2中部外顯子區(qū)域，直接造成fat2突變。

3 討論

組織器官表皮細(xì)胞的重要特征是具有極性，控制平面細(xì)胞極性(PCP)的分子途徑首先報(bào)道自果蠅的研究。在果蠅翅和眼中形成PCP 需要保守核心PCP 基因和調(diào)節(jié)基因參與[10-11]。果蠅卵巢卵室表皮是研究PCP 的良好模型。早期發(fā)現(xiàn)的突變體kug其卵室呈球形，明顯與野生型細(xì)長(zhǎng)的橢圓形卵室不同，肌動(dòng)蛋白纖維束方向與卵室形狀有關(guān)[19]。野生型果蠅卵室表皮細(xì)胞里肌動(dòng)蛋白纖維束方向垂直于果蠅卵室前后軸，而突變體kug卵室表皮細(xì)胞里肌動(dòng)蛋白纖維束方向紊亂，故認(rèn)為垂直于卵室前后軸分布的肌動(dòng)蛋白束提供分子束縛力，限制卵室垂直方向的生長(zhǎng)，使卵室呈細(xì)長(zhǎng)的橢圓形。突變體kug分離于幾十年以前，但直到2009 年才鑒定出其影響的基因?yàn)殁}粘著蛋白Fat2[18]。目前，kug的突變體有很多種，最早報(bào)道的kugel 003突變體在第75 位賴(lài)氨酸發(fā)生終止，從而產(chǎn)生突變[18-19]。本研究將實(shí)驗(yàn)室自建突變體MI3266進(jìn)行序列比對(duì)，Minos 轉(zhuǎn)座子插入到果蠅三號(hào)染色體左臂20015792 和20015793之間。結(jié)合fat2 結(jié)構(gòu)域可知：突變體在第19 個(gè)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，表型與fat2表型相同，經(jīng)鑒定影響的基因是fat2，表明MI3266是fat2的新突變體。從果蠅到哺乳動(dòng)物，F(xiàn)at 蛋白家族都是保守的，果蠅有Fat 和Fat-like (Fat2) 2 個(gè)成員，脊椎動(dòng)物有Fat-J、Fat1、Fat2 和Fat3 等4 個(gè)成員[20]。果蠅Fat2 與脊椎動(dòng)物Fat1、Fat2 和Fat3 序列相似度更近。

肌動(dòng)蛋白纖維束與培養(yǎng)的表皮細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞基底部的應(yīng)力纖維相似。應(yīng)力纖維形成受整聯(lián)蛋白影響。整聯(lián)蛋白是跨膜的異二聚體，它把胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架和細(xì)胞外基質(zhì)連接在一起。濾泡細(xì)胞里肌動(dòng)蛋白纖維末端與整聯(lián)蛋白相連，整聯(lián)蛋白異二聚體成員mys和mew突變體卵室變圓，發(fā)現(xiàn)mys和mew影響肌動(dòng)蛋白纖維束的極性[21]。受體酪氨酸磷酸酶Lar 與細(xì)胞外基質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架有關(guān)，它也影響肌動(dòng)蛋白纖維束的極性[21]。Fat2 胞內(nèi)區(qū)域與卵室延長(zhǎng)無(wú)關(guān)，與Fat2在細(xì)胞內(nèi)的分布密切相關(guān)[22]。在卵室發(fā)育1～8 時(shí)期，卵室會(huì)繞前后軸發(fā)生旋轉(zhuǎn)，曾認(rèn)為卵室旋轉(zhuǎn)是卵室延長(zhǎng)的先決條件。但是，去除胞內(nèi)區(qū)的Fat2 在體外條件下其卵室可以延長(zhǎng)至正常卵室長(zhǎng)度，卻不發(fā)生旋轉(zhuǎn)，暗示卵室旋轉(zhuǎn)不是卵室延長(zhǎng)的先決條件[22]。研究發(fā)現(xiàn)：缺失胞內(nèi)區(qū)Fat2 的卵室也可以旋轉(zhuǎn)，只是速度減慢，因此，卵室旋轉(zhuǎn)仍與卵室延長(zhǎng)相關(guān)[23]。此外，Dystrophin-Dystroglycan 復(fù)合體也與卵室延長(zhǎng)有關(guān)[24]，但PCP 仍有很多問(wèn)題沒(méi)有解釋清楚。根據(jù)反向PCR 擴(kuò)增MI3266插入基因組序列和fat2對(duì)應(yīng)的編碼蛋白的核酸序列比對(duì)結(jié)果可知：MI3266插入在Fat2第19 個(gè)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域之后還有10 余個(gè)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)，因此，Minos轉(zhuǎn)座子是插入到fat2胞外區(qū)。Minos轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)7 267 bp，且MI3266插在fat2外顯子內(nèi)，如此大的轉(zhuǎn)座子片段里很容易出現(xiàn)終止密碼子。當(dāng)?shù)鞍追g時(shí)，插入片段后面的編碼序列無(wú)法翻譯，導(dǎo)致Fat2 的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)以及部分胞外區(qū)缺失，而失去跨膜區(qū)的Fat2 是沒(méi)有功能的[22]，故推測(cè)fat2突變體的功能應(yīng)完全缺失。

4 結(jié)論

本研究鑒定到1 個(gè)不育果蠅突變體，其雌蠅不育，且雌蠅卵巢晚期卵室呈球形，背側(cè)肢短小。該突變影響的基因是fat2，其功能可能完全缺失。