朱 琨，劉驊峻，李 波

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省扎龍國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，黑龍江 齊齊哈爾 161002)

近年來，中國土地鹽堿化面積不斷增加，東北地區(qū)鹽漬土面積約為7.66×106hm2，該地區(qū)土壤含鹽量高，滲透性差，硬化嚴(yán)重，土壤致害鹽類為NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3，其中NaCl 和Na2SO4含量多的稱為鹽土，而Na2CO3和NaHCO3含量多的稱為堿土。大量鹽分積累會使土壤中離子含量升高，嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的發(fā)展[1-2]。外源激素和植物耐鹽性的研究引起了廣泛關(guān)注，尤其是赤霉素(gibberellins，GA3)在作物抗鹽性機(jī)理研究上的應(yīng)用。GA3作為一種促進(jìn)生長的植物激素，可調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)等多種生理活動，還能與植物體內(nèi)的吲哚乙酸和乙烯協(xié)同促進(jìn)植物生長，是植物生長發(fā)育過程中的必要激素。前人研究表明：通過施用微量外源GA3可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗鹽性[3]，對黃瓜(Cucumis sativusL.)[4]、水稻(Triticum aestivumL.)[5]和煙草(Nicotiana tabacum)[6]等多種植物的生長發(fā)育和抗逆境脅迫具有重要意義。在植物抵抗鹽的過程中，施用外源GA3可有效緩解高鹽環(huán)境對植物生長的抑制作用，減少鹽對細(xì)胞膜的傷害、增強(qiáng)抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)活性和提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[7-8]，從而提高植物的耐鹽性，因此，GA3對植物生長和抵抗逆境有著重要的調(diào)控作用。

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)為豆科(Leguminosae)苜蓿屬(Medicago)多年生草本植物，富含蛋白質(zhì)、微量元素和維生素等營養(yǎng)成分，抗逆境能力較強(qiáng)，生長迅速，已成為世界上最主要的飼料作物[9-10]。本研究以阿迪娜和龍牧801 紫花苜蓿為材料，探討外源GA3對鹽脅迫苜蓿幼苗的緩解效應(yīng)，從生理和生化方面綜合考察外源激素對鹽脅迫的緩解作用，為利用外源激素緩解鹽脅迫下苜蓿幼苗的生長提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以阿迪娜和龍牧801 紫花苜蓿種子為試驗(yàn)材料，種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿幼苗培養(yǎng)

采用土培法將種子播種在花盆中(高14 cm，直徑27 cm)，盆中針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按體積比 1.0∶2.0∶0.5 混合，定期澆水，將幼苗培養(yǎng)至三葉一心期。

1.2.2 幼苗鹽脅迫和激素處理

播種45 d 后，采用前期試驗(yàn)篩選的NaCl+Na2SO4混合鹽(2 種鹽濃度相同，體積比為1∶1)半致死濃度澆灌苜蓿幼苗，其中，阿迪娜幼苗澆灌200 mmol/L 混合鹽溶液100 mL，龍牧801 幼苗澆灌150 mmol/L 混合鹽溶液100 mL。每3 d澆1 次混合鹽溶液，共處理3 次，每個(gè)處理3 次重復(fù)。以澆等量去離子水的幼苗為對照組(CK)，處理結(jié)束后取其功能葉片保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

為了獲得有效的GA3濃度，向NaCl+Na2SO4混合鹽脅迫的2 種苜蓿幼苗葉片噴施不同濃度的GA3(表1)，以噴施去離子水為對照組(CK)，每3 d 噴施1 次，共緩解2 次，第2 次緩解結(jié)束后3 d采集葉片保存在-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。

表1 混合鹽濃度和GA3 質(zhì)量濃度Tab.1 Concentration of mixed salt and mass concentration of GA3

1.2.3 幼苗生理生化指標(biāo)的測定

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定：可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定；甜菜堿含量采用雷氏鹽法測定[11]。

保護(hù)酶活性的測定：過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase，PAL)活性采用分光光度法測定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用NBT 光化還原法測定[12]。

1.2.4 苜蓿幼苗鹽脅迫緩解效應(yīng)的綜合評價(jià)

采用隸屬函數(shù)法對各處理2 個(gè)苜蓿品種幼苗各項(xiàng)耐鹽指標(biāo)的隸屬值進(jìn)行累加，取平均值，并據(jù)此對2 個(gè)苜蓿品種進(jìn)行綜合評價(jià)。計(jì)算公式為：U(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式中：U(Xij)為某品種第i個(gè)處理組j項(xiàng)指標(biāo)的隸屬值，Xmin和Xmax分別為j項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Excel 2020 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用 SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3 對混合鹽脅迫下苜蓿幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖1 可知：外源GA3緩解NaCl+Na2SO4混合鹽脅迫時(shí)，隨著GA3質(zhì)量濃度的增加，可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿含量均呈先升高后降低的變化趨勢。各緩解組的可溶性糖和甜菜堿含量均高于CK 組和混合鹽脅迫組 (A組)，脯氨酸含量均高于CK 組；除60 mg/L GA3處理組外，其他緩解組的可溶性蛋白含量均高于A 組而低于CK 組?？梢姡┘右欢ㄙ|(zhì)量濃度GA3可積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以緩解混合鹽對苜蓿幼苗的脅迫。進(jìn)一步分析苜蓿葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累變化可知：60 或90 mg/L GA3處理下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)最多；除120 mg/L GA3處理組的脯氨酸含量外，其他各緩解組的4 種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均與A 組差異顯著(P＜0.05)。

圖1 2 種苜蓿幼苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量Fig.1 Content of osmotic adjustment substances in two alfalfa seedlings

2.2 GA3 對混合鹽脅迫下苜蓿幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響

由圖2 可知：外源GA3緩解NaCl 和Na2SO4混合鹽脅迫時(shí)，隨著GA3質(zhì)量濃度的增加，POD、CAT、SOD、APX 和PAL 活性均呈先升高后降低的變化趨勢，除阿迪娜的120 mg/L GA3處理組外，其他緩解組的5 種葉片保護(hù)酶活性均高于CK 組和混合鹽脅迫組 (A 組)?？梢姡┘右欢ㄙ|(zhì)量濃度GA3可促進(jìn)酶活性，以緩解混合鹽對苜蓿幼苗的脅迫。進(jìn)一步分析苜蓿葉片保護(hù)酶活性的變化可知：60～120 mg/L GA3處理下5 種酶活性均有較大提升，除SOD 活性外，其他各緩解組的4 種酶活性均顯著高于A 組(P＜0.05)。

圖2 2 種苜蓿幼苗的酶活性Fig.2 Enzyme activities in two alfalfa seedlings

2.3 外源GA3 對緩解苜蓿幼苗鹽脅迫的綜合評價(jià)

由表2 可知：不同質(zhì)量濃度(30～150 mg/L)GA3對苜蓿混合鹽脅迫均有良好的緩解作用，但相較于高質(zhì)量濃度GA3(120～150 mg/L)和低質(zhì)量濃度GA3(30 mg/L)處理，60 和 90 mg/L GA3處理緩解鹽脅迫的效果更好(平均隸屬函數(shù)值較大)；此外，60 mg/L GA3處理下阿迪娜的平均隸屬函數(shù)值最大(0.960)，而90 mg/L GA3處理下龍牧801 的平均隸屬函數(shù)值最大(0.905)，說明混合鹽耐性弱的龍牧801 較混合鹽耐性強(qiáng)的阿迪娜需要相對較高質(zhì)量濃度的外源GA3。

表2 激素緩解混合鹽脅迫下2 種苜蓿幼苗9 項(xiàng)指標(biāo)隸屬函數(shù)值Tab.2 Membership function values of nine indexes of two alfalfa seedlings under hormone alleviating mixed salt stress

3 討論

3.1 外源激素對植物葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物激素除在正常條件下控制植物的生長發(fā)育外，還可以調(diào)節(jié)包括鹽脅迫在內(nèi)的各種環(huán)境脅迫，從而調(diào)節(jié)植物的生長適應(yīng)性[13]。鹽脅迫可對植物造成滲透脅迫和離子毒害等不利影響，在調(diào)節(jié)植物應(yīng)對非生物脅迫的響應(yīng)中，植物激素的利用對調(diào)整體內(nèi)激素的代謝和信號發(fā)揮了重要的協(xié)同調(diào)控作用[14-15]。抵御鹽脅迫時(shí)，植物細(xì)胞可通過積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，緩解鹽離子進(jìn)入細(xì)胞造成植株失水而帶來的傷害[16]，且適宜的外源激素和濃度可促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。100 mmol/L NaCl 脅迫下，外源100 mg/L GA3可明顯增加德國鳶尾(Iris germanicaL.)的可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，緩解滲透脅迫造成的傷害[17]；用0.4% Na2SO4脅迫處理草莓(Fragaria×ananassaDuch.)，其植株體內(nèi)脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均下降，噴施外源 GA3可提高這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：在NaCl+Na2SO4脅迫下噴施一定質(zhì)量濃度的GA3可提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，其中，60 mg/L GA3處理下阿迪娜苜蓿葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和甜菜堿積累最多，90 mg/L GA3處理下龍牧801苜蓿葉片的可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿積累最多，與相關(guān)研究報(bào)道GA3緩解鹽脅迫的結(jié)論基本一致。施加外源GA3后，苜蓿幼苗可通過生理代謝的調(diào)節(jié)減輕NaCl+Na2SO4混合鹽脅迫造成的傷害，特別是 60～90 mg/L GA3處理能明顯增加混合鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，提高植株抗鹽害能力，這與外源激素GA3的調(diào)控作用密不可分。

3.2 外源激素對植物葉片保護(hù)酶活性的影響

植物體內(nèi)產(chǎn)生抗氧化酶以維持活性氧產(chǎn)生從而調(diào)控植物的一系列生理生化反應(yīng)，外源激素可以提高植物的抗鹽堿性，抵消鹽脅迫對植物生長的抑制作用[19]。0.3% NaCl 脅迫下，外源GA3能顯著提高泡桐幼苗葉片中的抗氧化酶活性，有效緩解鹽脅迫所引起的氧化損傷，提高植物的抗鹽能力[20]。本研究發(fā)現(xiàn)：NaCl+Na2SO4鹽脅迫下，苜蓿葉片的抗氧化酶活性均有不同程度的提高，其中，60 mg/L GA3處理下阿迪娜苜蓿幼苗的SOD、POD、APX 和PAL 活性均最高，120 mg/L GA3處理下CAT 活性最高；而龍牧801 苜蓿幼苗的5 種酶活性變化不同，POD 活性在GA360 mg/L、SOD活性在GA390 mg/L 以及CAT、APX 和PAL 活性在GA3120 mg/L 處理下最高。GA3可通過啟動不同的抗氧化酶系統(tǒng)緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗的傷害，與相關(guān)研究報(bào)道激素緩解鹽脅迫的結(jié)論基本一致。外源GA3處理可以通過增加植物抗氧化酶活性來提高植物的抗氧化能力，以抵抗非生物脅迫。

4 結(jié)論

在NaCl+Na2SO4鹽脅迫下，外源施加30、60、90、120 和150 mg/L GA3可使阿迪娜和龍牧801紫花苜蓿幼苗葉片積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并提高保護(hù)酶活性，以緩解混合鹽害，且60～90 mg/L GA3處理的緩解作用最好。