葉紅玲 李娜 曾健 侯思南

1南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬連云港第二人民醫(yī)院連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，連云港 222002；2連云港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，連云港 222004

丙型肝炎病毒（HCV）在我國某些地區(qū)呈低流行狀態(tài)，蔣均等［1］建議加強(qiáng)對1957—1986年出生人群和血液透析科、感染科及肝病科就診者HCV感染的血清學(xué)篩查?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）通過檢測抗HCV抗體（Anti-HCV）成功地應(yīng)用于HCV感染者的篩查，具有動態(tài)范圍寬、高特異性、高靈敏度、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)［2-3］。Anti-HCV的檢測通常是定性的，要么是陽性，要么是陰性。運(yùn)用雅培i2000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測HCV抗體雖可檢出陽性患者，但存在假陽性結(jié)果，臨床應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用［4-5］。一些研究發(fā)現(xiàn)，吸光度和臨界值比值（S/CO）的樣品通常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。在血液透析患者等免疫功能低下的人群中，出現(xiàn)抗-HCV抗體假陽性的結(jié)果在15%左右［6］。Dufour等［7］對S/CO的樣本做了重組免疫印跡分析（recombinant immunoblot assay，RIBA）檢測，發(fā)現(xiàn)86%的樣本為HCV陰性，故建議對低陽性值的樣本進(jìn)行RIBA補(bǔ)充試驗(yàn)以避免報(bào)告假陽性結(jié)果［8］。Heinrichs等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HCV血清學(xué)檢查在有左心輔助設(shè)備（LVAD）的患者中存在假陽性，建議此類患者的CLIA反應(yīng)陽性應(yīng)通過HCV免疫印跡和HCV RNA檢測確認(rèn)，以排除HCV感染。陸銀華等［10］建議對i2000SR檢測Anti-HCV灰區(qū)（S/CO值為1.00～9.41）樣本，應(yīng)至少使用2種檢測系統(tǒng)或使用高特異性的檢測系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)檢。對于低陽性值樣本，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)充分考慮不同檢測系統(tǒng)之間可能出現(xiàn)的結(jié)果不一致現(xiàn)象，制定合理灰區(qū)范圍和確定最佳臨界值［11-15］。

內(nèi)源性干擾在臨床免疫檢測中較為常見。檢驗(yàn)人員應(yīng)采取措施，識別和排除內(nèi)源性干擾物，保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性［16］。動物血清或動物源性免疫球蛋白通常用來封閉嗜異性抗體（HA），當(dāng)其與待測樣本共同孵育后，能結(jié)合樣本中的HA或人抗動物抗體（HAAA），通過空間位阻阻遏HA/HAAA與檢測或捕獲抗體結(jié)合，從而封閉HA/HAAA的 干 擾 作 用［17］。Batteiger等［18］使 用 含 非 離 子 洗 滌 劑Tween20的PBS作為阻斷劑，能有效阻斷硝酸纖維素膜（NCM）上未被占據(jù)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，獲得的條帶背景明顯低于使用大量牛血清白蛋白（BSA）或載體血清作為阻斷劑。為了消除內(nèi)源性干擾物對抗-HCV抗體的干擾，我們分別采用小鼠血清（MS）和磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween buffer，PBST）封閉患者標(biāo)本可能存在的非特異性抗體，處理后以CLIA法復(fù)檢，并評價(jià)干擾消除效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1、研究材料

1.1、研究對象研究病例是連云港市中醫(yī)院檢驗(yàn)科2017年2月至2019年11月間-20℃保存的雅培i2000SR化學(xué)發(fā)光儀檢測的丙肝抗體結(jié)果即標(biāo)本S/CO>1的血清樣本151例、S/CO<1的血清樣本40例（通過LIS系統(tǒng)查詢初篩檢驗(yàn)報(bào)告）。當(dāng)S/CO比值>1.0時(shí)初篩試驗(yàn)判斷為陽性反應(yīng)。連云港市中醫(yī)院倫理委員會根據(jù)《赫爾辛基原則宣言》審查通過了此研究方案。

1.2、設(shè)備與試劑雅培i2000SR全自動化學(xué)發(fā)光儀（廠家：美國雅培公司，配套丙肝抗體試劑，批號：03231BE00、03586BE00、03531BE00、04539BE00、94016LI00等）；小鼠血清封閉液（廠家：北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，生產(chǎn)批號：80M00150）；Tween20（廠家：歐蒙醫(yī)學(xué)診斷中國有限公司，批號：F190403CA）；PBS（廠家：歐蒙醫(yī)學(xué)診斷中國有限公司，批號：F191010CB）；丙肝抗體質(zhì)控品（廠家：北京康徹斯坦公司，濃度：2 NCU/ml，批號：201811002）。丙肝抗體確證（RIBA）和HCV-RNA外送金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢驗(yàn)。

2、研究方法

本研究為病例對照研究。對所有受試標(biāo)本以RIBA法檢測，對結(jié)果為不確定的標(biāo)本加做HCV RNA。以確證試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，采用Kappa檢驗(yàn)比較處理前后一致性，并繪制丙肝抗體受試者工作特征曲線（ROC），從而明確Anti-HCV的最佳診斷界值和灰區(qū)范圍?；覅^(qū)的標(biāo)本用正常小鼠血清、PBST分別封閉處理后，以雅培i2000SR復(fù)檢丙肝抗體。所有操作嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。

按廠家說明書配置0.1%（W/V）PBST。小鼠血清在使用前需經(jīng)56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體。處理步驟如下：（1）在2個(gè)EP管內(nèi)各加入患者血清200 μl，其中1管加入小鼠血清200 μl，另1管加入0.1%（W/V）PBST 200 μl，充分混勻。（2）將小鼠血清管置于37℃水浴30 min，PBST管、小鼠血清管靜置于室溫1 h。（3）小鼠血清管以2 000 g/min瞬間離心，PBST管以3 500 g/min離心10 min。（4）兩管均在雅培i2000SR上復(fù)測Anti-HCV，檢驗(yàn)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)2。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的計(jì)量資料符合正態(tài)分布，使用SPSS 24.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Kappa檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若Kappa<0.4，則表示一致性較差；若0.75>Kappa≥0.4，則表示一致性一般，若Kappa≥0.75，則表示一致性較好。以確認(rèn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)本處理前后丙型肝炎病毒抗體的ROC。

結(jié) 果

1、以雅培i2000SR檢測Anti-HCV的最佳診斷界值的確立

見表1和圖1。雅培i2000SR檢測Anti-HCV項(xiàng)目時(shí)，不同的S/CO比值靈敏度、特異度、約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1）分別如表1所示。因?yàn)榧s登指數(shù)越接近于1診斷效能最佳，從而可以看出當(dāng)Anti-HCV的S/CO比值為5.02時(shí)，約登指數(shù)為最高值（0.919），所對應(yīng)的靈敏度為97.4%，特異度為94.5%，將其確定為最佳S/CO比值。Anti-HCV的S/CO比值在0.89時(shí)，靈敏度為100.0%；Anti-HCV的S/CO比值5.97時(shí)，特異度為100.0%，因此Anti-HCV的灰區(qū)范圍設(shè)置為0.89～5.97。

表1 雅培i2000SR檢測Anti-HCV的不同臨界值條件下的診斷效能

2、兩種方法處理前后Anti-HCV與確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的一致性及診斷效能變化

RIBA檢驗(yàn)結(jié)果為陰性75例，陽性109例，不確定7例，經(jīng)加做HCV RNA補(bǔ)充試驗(yàn)最終確認(rèn)陰性為76例，陽性為115例。通過整理對比被測者復(fù)檢和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果，觀察灰區(qū)標(biāo)本在處理前后與確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的差異性，如表2所示?；覅^(qū)標(biāo)本未做處理、小鼠血清和PBST處理后，Anti-HCV與確證試驗(yàn)結(jié)果的一致性Kappa值分別為0.551、0.900、0.854；以i2000SR檢測Anti-HCV的靈敏度分別為98.3%、100.0%、99.1%，特異度分別為52.6%、88.1%、84.2%，陽性預(yù)測值分別為75.8%、92.7%、90.5%，陰性預(yù)測值分別為95.2%、100.0%、98.5%。

表2 兩種方法處理前后Anti-HCV與確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的一致性及診斷效能變化

3、以確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)繪制的標(biāo)本在處理前后檢測Anti-HCV項(xiàng)目的ROC

雅培i2000SR檢測Anti-HCV的曲線下面積（AUC）分別為0.980、0.996和0.987?；覅^(qū)標(biāo)本處理前、小鼠血清和PBST封閉后，i2000SR檢 測Anti-HCV ROC分析 的AUC分別為0.980、0.996、0.987，以小鼠血清封閉法AUC最大（圖1和表3）。

表3 基于151例灰區(qū)標(biāo)本處理前后Anti-HCV檢測數(shù)據(jù)繪制ROC曲線下面積

圖1 以確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)繪制的標(biāo)本處理前后Anti-HCV的ROC

討 論

裘宇容等［19］研究發(fā)現(xiàn)，與臨床不符的丙型肝炎抗體陽性（電化學(xué)發(fā)光法及ELISA法）標(biāo)本應(yīng)用綿羊血清封閉人血清中的HA以排除干擾，檢測封閉后標(biāo)本的Anti-HCV，結(jié)果為陰性。雅培i2000SR運(yùn)用CLIA法定性測定人血清中的Anti-HCV。整個(gè)檢測過程首先將待檢血清、項(xiàng)目稀釋液、HCV抗原包被的順磁微粒子混合。待檢血清Anti-HCV和HCV抗原包被的微粒子充分結(jié)合。經(jīng)過沖洗后，加入吖啶酯標(biāo)記的鼠抗人熒光抗體，再次沖洗，將預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液加入到反應(yīng)液中，通過測定發(fā)光值判斷待測血清中的HCV抗體含量。由于結(jié)合物中的熒光標(biāo)記的抗體是鼠抗人抗體，而我們研究所選擇的是正常小鼠血清封閉待測血清，所以有可能存在非特異性抗體后要再次復(fù)檢。

Arya等［20］報(bào)道了一種用于檢測和估計(jì)乳腺癌的生物標(biāo)志物-人表皮生長因子受體2（HER2）的電容式傳感器研制。該研究包括用于制備電化學(xué)平臺的插入叉指金電極，采用與HER2親和的巰基末端DNA適體制備生物識別層通過在叉指金表面上的自組裝，用0.05%吐溫20（PBST-20）阻斷劑阻止表面的可用空間，從而阻止了非特異結(jié)合。在復(fù)檢灰區(qū)標(biāo)本的ARCHITECT i2000SR Anti-HCV時(shí)，本研究用終濃度為0.05%的Tween20（PBST-20），阻斷重組HCV抗原表面未被Anti-HCV占據(jù)的可用空間，封閉了標(biāo)本中干擾物的非特異性結(jié)合，從而提高了雅培i2000SR檢測Anti-HCV的準(zhǔn)確性。

此次研究結(jié)果表明，雅培i2000SR檢測灰區(qū)標(biāo)本時(shí)標(biāo)本處理前和在小鼠血清和PBST封閉后對比，Anti-HCV與確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的一致性均明顯增高，以小鼠血清封閉最為明顯；ARCHITECT i2000SR檢測Anti-HCV的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值還有AUC都提高顯著，其中正常小鼠血清封閉檢驗(yàn)效能最為顯著。證實(shí)用正常小鼠血清消除免疫干擾的效果最理想。

在實(shí)踐中很難確定消除患者樣本中所有干擾的阻斷劑的準(zhǔn)確用量，因?yàn)閷τ诟蓴_的免疫反應(yīng)性抗體在個(gè)體之間變化很大，所加入的阻斷劑的有效性取決于其種類和亞類［21］。此次研究結(jié)果雖然表明利用小鼠血清封閉或PBST處理后檢驗(yàn)效能會有很大提高，但是還是有少數(shù)假陽性標(biāo)本在處理之后還會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，而此樣標(biāo)本仍然需要進(jìn)行HCV確認(rèn)試驗(yàn)。RIBA檢測的是丙型肝炎病毒感染者血液中的抗HCV抗體，主要用于一線篩查時(shí)丙型肝炎病毒檢測顯示陽性或不確定結(jié)果的二次確認(rèn)試驗(yàn)［22］。

Chiu等［21］認(rèn)為，當(dāng)懷疑實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和臨床不一致時(shí)，實(shí)驗(yàn)室檢測干擾可能需要使用另一種方法。Huang等［23］分別使用Elecsys電化學(xué)發(fā)光（ECL）和雅培化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析（CMIA），采用雙檢法測定抗-HCV的策略，以減少抗-HCV檢測中的假陽性；或使用附加阻斷劑，或用非免疫血清中和稀釋樣本。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)意識到所有免疫分析的潛在干擾，以及人工結(jié)果如何可能導(dǎo)致誤解、隨后的錯誤診斷和不合理的治療。這些干擾雖然是相對不常見的，但是臨床醫(yī)生需要意識到它們有存在的可能性，并警惕臨床和生物數(shù)據(jù)的不匹配。王菊英等［24］研究發(fā)現(xiàn)，由于HCV RNA存在間歇性復(fù)制特點(diǎn)，可能會導(dǎo)致RIBA檢測陽性而RNA檢測陰性的情況發(fā)生；而要明確丙肝是否為現(xiàn)癥感染，則需要檢測HCV抗體陽性者血中HCV RNA載量［25］，因此對這種異常測試結(jié)果的識別需要實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)生的持續(xù)監(jiān)控。加強(qiáng)臨床醫(yī)生與臨床實(shí)驗(yàn)室就意外事件的溝通，可避免基于異常的免疫檢測結(jié)果的不適當(dāng)臨床干預(yù)。利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突