劉云富 游慧圓 吳燕梅

1惠州市職業(yè)病防治院理化室，惠州 516008；2惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，惠州 516008

毒鼠強(qiáng)，又名四亞甲基二砜四胺，分子式：C4H8N4O4S2，分子量240.27。毒鼠強(qiáng)是20世紀(jì)中期研發(fā)的急性殺鼠藥，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，具有強(qiáng)烈的致驚厥作用，對(duì)各類動(dòng)物，包括人類毒性都極高，由于其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在生物體內(nèi)也不易降解，故容易造成長(zhǎng)期的鏈條性的污染，造成嚴(yán)重的危害［1］。中國(guó)已明令禁止生產(chǎn)、使用。氟乙酰胺：俗名敵蚜胺，分子式：C2H4FNO，分子量77.06。氟乙酰胺屬高毒鼠藥，進(jìn)入人體后脫胺形成氟乙酸，干擾正常的三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致三磷酸腺苷合成障礙及氟檸檬酸直接刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)及精神癥狀。由于其具有高毒性及穩(wěn)定性，在20世紀(jì)90年代國(guó)家已明令禁止使用該種鼠藥。雖然國(guó)家已經(jīng)明令禁止生產(chǎn)使用毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺，然而因?yàn)闇缡笮Ч茫杀镜土?，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，故仍然存在濫用情況［2-3］。在醫(yī)院的急診搶救實(shí)踐中，仍會(huì)遇到因誤食、服毒自殺或投毒所致的病人。溴敵隆，又名樂(lè)萬(wàn)通、溴敵鼠，分子式：C30H23BrO4，分子量527.41。溴敵隆在質(zhì)譜中會(huì)碎裂成另一種物質(zhì)（為3種同分異構(gòu)體之一），分子式：C14H11Br，分子量259.14。以溴敵隆為代表的第二代長(zhǎng)效抗凝血滅鼠藥為我國(guó)市面上流行的主流滅鼠藥。長(zhǎng)效抗凝血滅鼠藥主要通過(guò)人體消化道攝入引起中毒，主要毒理作用是抑制維生素K依賴性凝血因子的合成，導(dǎo)致凝血障礙［4］?？梢鹌つw和臟器出血，中毒后以全身各器官組織的出血為主要表現(xiàn)，例如血尿、鼻衄、顱內(nèi)出血等，同時(shí)伴有凝血指標(biāo)的異常。由于管理疏漏或使用不當(dāng)，臨床上常見因誤食、自殺、投毒等原因?qū)е碌脑擃愂笏幹卸净颊撸?-9］。當(dāng)前，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于毒鼠強(qiáng)和氟乙酰胺的同時(shí)測(cè)定大多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)于毒鼠強(qiáng)和溴敵隆的同時(shí)測(cè)定，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，尚未見對(duì)于3種殺鼠劑同時(shí)測(cè)定的報(bào)道［10-19］。本實(shí)驗(yàn)利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定上述種殺鼠劑，方法的檢出限低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于急性化學(xué)中毒中，可疑鼠藥中毒生物樣品中上述3種殺鼠劑的定性定量測(cè)定。

材料與方法

2022年5月至6月于惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)。

1、儀器與試劑

1.1、儀器氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（三重串聯(lián)四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜儀，廠家：島津，型號(hào)：GCMS-TQ8040）；VF-1701ms毛 細(xì) 管 色 譜 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；KQ7200DV超聲波清洗器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Organomation氮?dú)鉂饪s儀（N-EVAP?111）；SL-0246漩渦振蕩器（美國(guó)Scientific Industries公司）；H1650高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；帶10μl微量注射器的自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.2、試劑毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)品（北京中衛(wèi)永晟科技有限公司，濃度：200μg/ml）、氟乙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，濃度：100μg/ml）、溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，濃度：100 μg/ml）；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉：分析純；乙酸乙酯：色譜純。

2、色譜條件

柱溫：初溫40.0℃，保持5.0 min，然后以10.0℃/min升到125.0℃，再以20.0℃/min升到270.0℃，保持3.0 min。進(jìn)樣口溫度程序：280.0℃，保持時(shí)間：10.0 min；以高壓進(jìn)樣模式進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力：250.0 kpa，高壓進(jìn)樣時(shí)間：1.0 min；載氣為氦氣，柱流量：1.00 ml/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：2μl。

3、質(zhì)譜條件

離子源溫度：230℃；接口溫度：300℃；EI電壓：+0.60 eV；溶劑延遲時(shí)間：4.0 min；掃描范圍：10～550 amu；SIM離子掃描，毒鼠強(qiáng)：212（定量離子），240，132；氟乙酰胺：44（定量離子），77，60；溴敵隆：258（定量離子），260，178。

4、樣品前處理方法

4.1、血樣移取2 ml血樣于10 ml離心管中，漩渦振蕩（2 000 r/min）1 min，離心（14 000 r/min）5 min，離心半徑15 mm，血漿/血清全部轉(zhuǎn)移至離心管中，加入2 ml乙酸乙酯和1 g氯化鈉，將離心管置于超聲儀內(nèi)進(jìn)行超聲萃取5 min，再離心（14 000 r/min）5 min，取出全部上清液于5 ml具塞刻度錐形玻璃管中，置于40℃氮吹儀中濃縮吹至0.2 ml（或者吹干，然后再加200μl復(fù)溶，振搖1 min，靜置。若含有水分導(dǎo)致吹不干，需用無(wú)水硫酸鈉脫水），進(jìn)樣2μl（如果濃縮液渾濁，則要過(guò)濾后進(jìn)樣）。

4.2、尿樣振搖尿樣，靜置，取2 ml尿樣+1 ml乙酸乙酯+1 ml丙酮+1 g氯化鈉于10 ml離心管中，以下前處理步驟同血樣處理。

5、混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

取2 ml容量瓶，先加入少量乙酸乙酯，然后分別加入500 μl毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液、200 μl氟乙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，500 μl溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯定容至刻度，得到乙酸乙酯中毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺和溴敵隆濃度分別為50μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的3種滅鼠劑混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

結(jié) 果

1、總離子流色譜圖及質(zhì)譜圖

在選定的分析條件下，采用全離子掃描（SCAN）模式對(duì)加入乙酸乙酯、血樣和尿樣中的3種滅鼠劑進(jìn)行測(cè)定，用NIST庫(kù)對(duì)色譜峰進(jìn)行譜庫(kù)檢索，其總離子流色譜圖及質(zhì)譜圖見圖1～圖6?？傠x子流色譜圖中，氟乙酰胺的色譜峰保留時(shí)間為6.216 min，毒鼠強(qiáng)的色譜峰保留時(shí)間為20.759 min，溴敵隆色譜峰的保留時(shí)間為20.934 min。根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖選取豐度相對(duì)較高的特征離子碎片進(jìn)行SIM模式檢測(cè)，選取的離子為：毒鼠強(qiáng)：42，212（定量離子），240；氟乙酰胺：44（定量離子），60，77；溴敵?。?78，258（定量離子），260。

圖1 3種滅鼠劑的總離子流色譜圖(標(biāo)準(zhǔn)溶液)

圖6 溴敵隆的質(zhì)譜圖

2、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限、定量下限

于2 ml血樣和尿樣中各加入毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺、溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)貯備液各16μl、32μl、64μl、128μl、320μl。按樣品前處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，以各目標(biāo)物的定量離子色譜峰峰面積y對(duì)其質(zhì)量濃度x（μg/ml）進(jìn)行線性回歸處理，3種殺鼠劑的檢出限和定量下限計(jì)算結(jié)果見表1。按照職業(yè)人群生物監(jiān)測(cè)方法推薦的檢出限和定量下限測(cè)定方法［20］。以低濃度樣品，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析，以樣品信號(hào)的3（10）倍標(biāo)準(zhǔn)差（n=7），與低劑量的待測(cè)物濃度及其響應(yīng)值計(jì)算所得的待測(cè)物濃度，所得濃度即為方法檢出限（MDL）、定量下限（MQL），計(jì)算公式：

表1 3種滅鼠劑工作曲線、檢出限和定量下限

K：樣品預(yù)處理體積轉(zhuǎn)換倍數(shù)；S：測(cè)定響應(yīng)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差；c：配制的3種殺鼠劑的低劑量濃度；b：c對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)。

3、方法回收率實(shí)驗(yàn)與方法精密度實(shí)驗(yàn)

取空白血樣和尿樣，配制血中毒鼠強(qiáng)濃度分別為0.6μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，尿中毒鼠強(qiáng)濃度分別為0.3 μg/ml、0.5 μg/ml、1.5 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，血中氟乙酰胺濃度分別為0.07μg/ml、0.17μg/ml、0.4μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，尿中氟乙酰胺濃度分別為0.3 μg/ml、0.5 μg/ml、1.5 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，血和尿中溴敵隆濃度分別為0.3 μg/ml、0.7 μg/ml、3.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣品處理后，各進(jìn)行6次平行測(cè)定，最后計(jì)算每種殺鼠劑的平均回收率和相對(duì)，結(jié)果見表2。

表2 樣品中3種殺鼠劑回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖2 3種滅鼠劑的總離子流色譜圖（血樣）

圖3 3種滅鼠劑的總離子流色譜圖（尿樣）

圖4 氟乙酰胺的質(zhì)譜圖

圖5 毒鼠強(qiáng)的質(zhì)譜圖

結(jié) 論

用乙酸乙酯為提取溶劑，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定疑似鼠藥中毒患者血液和尿液樣品中的毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺和溴敵隆，利用全掃描選定特征離子和選擇性離子掃描進(jìn)行定性，測(cè)定特征定量離子的峰面積、外標(biāo)法定量，方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適合于疑似鼠藥中毒生物樣品中毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺和溴敵隆的快速定性定量測(cè)定。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉云富：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，撰寫論文；游慧圓：開展實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采集；吳燕梅：開展實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采集