楊月 張會芳 陳妙玲 韓玉貞

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 256600

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，且近年來其發(fā)病率和病死率仍在不斷增加［1］。免疫治療是繼手術(shù)、放化療等治療之外新興的治療手段，程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是免疫治療的重要靶點，PD-L1通過與淋巴細(xì)胞，主要為CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）表面程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）結(jié)合發(fā)揮其免疫抑制作用。近年來有關(guān)PD-L1和CD8+TILs在乳腺癌中的研究較多，但結(jié)果很不一致［2-6］。由于大多數(shù)乳腺癌TILs較少，而PD-L1的免疫抑制作用是以腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤為前提［7］，這可能是研究結(jié)果不一致的原因之一。富于淋巴細(xì)胞型乳腺癌（lymphocyte-predominant breast cancer，LPBC）是一類富含淋巴細(xì)胞的乳腺癌，且瘤內(nèi)和間質(zhì)含有豐富的CD8+TILs，以LPBC為研究對象能更好地探討PD-L1和CD8+TILs表達(dá)之間的關(guān)系。為此，本研究探討LPBC中PD-L1和CD8+TILs的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1、資料

選取濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2011年1月至2018年12月有完整臨床病理資料的LPBC 60例，包括年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級和Ki-67增殖指數(shù)。由2名病理醫(yī)師參照國際TILs工作組2014年提出的評估標(biāo)準(zhǔn)［8］對TILs進(jìn)行評估，LPBC定義為乳腺癌間質(zhì)TILs≥50%（圖1A）。納入對象均為女性，在術(shù)前均未接受過治療。通過電話或查詢病歷對LPBC患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，時間截止至2021年12月或患者死亡，中位隨訪時間78個月（22～127個月）。

2、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴入組患者均診斷為浸潤性導(dǎo)管癌，并由2名病理醫(yī)師參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評估為LPBC；⑵入組患者均具有完整的臨床病理資料，包括年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級和Ki-67增殖指數(shù)；⑶LPBC試驗標(biāo)本均為手術(shù)切除大標(biāo)本；⑷入組患者術(shù)前均未進(jìn)行任何治療，包括新輔助放、化療，靶向治療，內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理及臨床資料不完整的患者；⑵乳腺穿刺標(biāo)本；⑶其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移到乳腺的患者；⑷術(shù)前進(jìn)行過治療，包括新輔助放、化療，靶向治療，內(nèi)分泌治療。

3、方法與試劑

應(yīng)用免疫組化EnVision法染色。用10%中性福爾馬林溶液對標(biāo)本進(jìn)行固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化處理后，采用EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加PD-L1（SP142，1∶50）、CD8一抗37℃放置2 h后棄去，滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白（Ig）G聚合物二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹脂封片。用扁桃體組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。一抗PD-L1購自美國Abcam公司，CD8、二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。LEICA EG1160包埋機(jī)、LEICA RM2245切片機(jī)均購自德國LEICA公司，漂片烘片儀購自杭州中威電子制造，37℃恒溫箱購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

4、結(jié)果判讀

⑴PD-L1陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)：PD-L1陽性定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)（圖1B、C），任何強(qiáng)度PD-L1染色的腫瘤細(xì)胞（tumor cell，TC）或免疫細(xì)胞（immune cell，IC）為陽性細(xì)胞，分別記錄陽性TC和IC在腫瘤細(xì)胞巢和腫瘤周圍間質(zhì)中所占的百分比，≥1%定義為陽性，＜1%為陰性［9］。⑵CD8判讀標(biāo)準(zhǔn)：CD8陽性著色定位于為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)（圖1D），接觸或位于腫瘤細(xì)胞巢內(nèi)的淋巴細(xì)胞定義為iTILs，而間質(zhì)區(qū)域內(nèi)的淋巴細(xì)胞被定義為sTILs，不包括導(dǎo)管原位癌和正常乳腺組織周圍間質(zhì)TILs。⑶CD8+iTILs和CD8+sTILs的判讀標(biāo)準(zhǔn)：低倍鏡下觀察全片，排除熱點區(qū)域，選取5個高倍視野（400×）并用CellSens Entry軟件進(jìn)行閱片，用多邊形工具分別勾勒出腫瘤細(xì)胞巢和間質(zhì)區(qū)域的面積，分別計數(shù)腫瘤細(xì)胞巢和間質(zhì)區(qū)域中CD8+細(xì)胞數(shù)，CD8+TILs的密度以陽性細(xì)胞數(shù)/mm2表示。

圖1 A：富于淋巴細(xì)胞型乳腺癌，sTILs≥50%（HE染色200×）；B：PD-L1在 腫 瘤 細(xì) 胞 中 呈 陽 性（EnVision法200×）；C：PD-L1在免疫細(xì)胞中呈陽性（EnVision法200×）；D：CD8在間質(zhì)和瘤內(nèi)Tils中的表達(dá)（EnVision法100×）

5、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析LPBC中PD-L1和CD8+TILs表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Spearman秩相關(guān)檢驗分析PD-L1和CD8+TILs表達(dá)的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并行Log-Rank檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、LPBC患者的臨床病理特征

本文共篩選出LPBC 60例，患者均為女性，中位年齡51歲（29～71歲），腫塊中位直徑為2.5 cm（1.5～6.5 cm），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率40.0%（24/60）。組織學(xué)類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，其中組織學(xué)分級Ⅰ級0例，組織學(xué)分級Ⅱ級42例，組織學(xué)分級Ⅲ級18例。60例LPBC患者中位隨訪時間為78個月（22～127個月），在隨訪期間有4例患者復(fù)發(fā)（6.7%）、3例患者死亡（5.0%）。

2、TC和IC中PD-L1的表達(dá)與LPBC臨床病理特征的關(guān)系

PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為26.7%（16/60），PD-L1在免疫細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為73.3%（44/60），總PD-L1陽性表達(dá)率為81.7%（49/60）。PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)（P=0.041），與年齡、腫塊大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67均無關(guān)（均P>0.05）。PD-L1在免疫細(xì)胞中的表達(dá)與腫塊大?。≒=0.004）、Ki-67有關(guān)（P=0.001），與年齡、組織學(xué)分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P>0.05）。見表1。

表1 PD-L1與60例LPBC患者臨床病理特征的關(guān)系

3、不同部位CD8+TILs與LPBC患者臨床病理特征的關(guān)系

本研究CD8+TILs檢測數(shù)值：CD8+sTILs中位數(shù)為807（295～2 454），CD8+iTILs中位數(shù)為108（0～634）；以中位數(shù)為臨界值分為低密度組和高密度組。CD8+sTILs和CD8+iTILs的表達(dá)與年齡、腫塊大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、Ki-67差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表2。

表2 不同部位CD8+TILs與60例LPBC患者臨床病理特征的關(guān)系

4、LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相關(guān)性分析

腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與CD8+iTILs的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.301，P=0.019），免 疫 細(xì) 胞 中PD-L1的 表 達(dá) 與CD8+sTILs的表 達(dá) 無明 顯 相關(guān) 性（rs=-0.155，P=0.239），見圖2。

圖2 60例LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相關(guān)性分析。A：腫瘤細(xì)胞中PD-L1和CD8+iTILs表達(dá)的相關(guān)性；B：免疫細(xì)胞中PD-L1和CD8+sTILs表達(dá)的相關(guān)性

5、PD-L1和CD8+TILs的表達(dá)對預(yù)后的影響

腫瘤和間質(zhì)PD-L1表達(dá)與患者的無瘤生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）均無顯著相關(guān)性（均P>0.05）。CD8+sTILs高密度組與較長的DFS相關(guān)（P=0.037，圖3A），CD8+sTILs的表達(dá)與OS無顯著相關(guān)性（P=0.084，圖3B）；CD8+iTILs高密度組與較短的DFS相關(guān)（P=0.042，圖3C），CD8+iTILs的表達(dá)與OS無顯著相關(guān)性（P=0.076，圖3D）。

圖3 60例LPBC患者的Kaplan-Meier生存曲線。A：不同密度CD8+sTILs與無瘤生存期的關(guān)系；B：不同密度CD8+sTILs與總生存期的關(guān)系；C：不同密度CD8+iTILs與無瘤生存期的關(guān)系；D：不同密度CD8+iTILs與總生存期的關(guān)系

討 論

腫瘤微環(huán)境包括免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)成分，乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，并因其具有潛在的治療靶點而倍受關(guān)注［2］。許多研究表明，sTILs密度高的患者預(yù)后較好，TILs可作為判斷乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)，其中CD8+TILs在殺滅癌細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用［10］。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞按照所處的部位不同分為間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞和瘤內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞。Catacchio等［11］研究發(fā)現(xiàn)，總CD8+T細(xì)胞與DFS無顯著相關(guān)性，而CD8+iTILs高表達(dá)的患者顯示出更差的5年DFS，CD8+sTILs高表達(dá)的患者顯示出更好的5年DFS。Chen等［12］研 究 顯 示，淋 巴 結(jié) 陰 性 乳 腺 癌 中CD8+iTILs高表達(dá)與DFS和OS的改善有關(guān)。Liu等［13］對3 403例浸潤性乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，32.4%的患者每0.6 mm直徑的組織芯片至少有1個CD8+iTIL，60.6%的患者至少有1個CD8+sTIL；由此看出，非LPBC患者CD8+TILs數(shù)量較少，尤其是CD8+iTILs數(shù)量更少，經(jīng)常被研究者們忽略。iTILs與腫瘤細(xì)胞直接接觸，可以更好地發(fā)揮腫瘤免疫作用。本文選取的是富于TILs的一類乳腺癌，能夠更好地反映瘤內(nèi)和間質(zhì)CD8+TILs與預(yù)后的關(guān)系。本研究顯示CD8+sTILs高表達(dá)患者具有更好的DFS，而CD8+iTILs高表達(dá)組顯示更差的DFS，提示不同部位CD8+TILs對乳腺癌有不同的預(yù)測預(yù)后作用。本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與CD8+iTILs表達(dá)呈正相關(guān)，腫瘤細(xì)胞PD-L1抑制了CD8+iTILs的腫瘤免疫作用，這可能是CD8+iTILs高表達(dá)患者預(yù)后差的原因。

PD-1/PD-L1免疫檢查點通路是誘導(dǎo)乳腺癌免疫逃逸的重要機(jī)制之一，PD-L1與PD-1結(jié)合可抑制T淋巴細(xì)胞的激活、增殖和細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的分泌［14］。近期美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)阿替利珠單抗（atezolizumab）聯(lián)合化療（abraxane，紫杉醇）用于治療PD-L1陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌（TNBC）患者［15］。一項基于2 500例乳腺癌的meta分析顯示PD-L1陽性率在21%～56%范圍內(nèi)［16］。本研究顯示PD-L1在免疫細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，這與大多數(shù)研究結(jié)果一致［6，17］，然而PD-L1在LPBC中的總陽性表達(dá)率高達(dá)81.7%。PD-L1在LPBC中高表達(dá)可能與高浸潤性TILs介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)有關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1發(fā)揮免疫抑制作用。有研究表明，在所有類型的乳腺癌中，較短的OS和PD-L1表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)［18］；但也有研究顯示，在TNBC中，PD-L1陽性患者預(yù)后更好［19］。Huang等［20］研究發(fā)現(xiàn)TC中PD-L1的表達(dá)與大直徑腫塊、高組織學(xué)分級、高Ki-67、ER和PR陰性相關(guān)。Calik等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中腫瘤細(xì)胞PD-L1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，而免疫細(xì)胞中PD-L1的高表達(dá)與預(yù)后良好相關(guān)。本研究表明，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)，PD-L1在免疫細(xì)胞中的表達(dá)與腫塊大小和Ki-67有關(guān)；PD-L1無論在腫瘤細(xì)胞還是免疫細(xì)胞中的表達(dá)都與DFS和OS無相關(guān)性。由于該類乳腺癌預(yù)后好，病死率低，本研究的病例相對較少，可能沒能更好地反映PD-L1與預(yù)后的關(guān)系；但從與一些預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)分析來看，PD-L1陽性表達(dá)與一些不良的臨床病理參數(shù)相關(guān)。

免疫治療開始時，治療效果在很大程度上是由腫瘤內(nèi)已經(jīng)存在的TILs介導(dǎo)的，主要是CD8+TILs，具有豐富CD8+TILs的乳腺癌可能對PD-L1免疫抑制劑有更好的療效。有關(guān)PD-L1和CD8+TILs的相關(guān)性研究多集中于乳腺癌間質(zhì)，而有關(guān)腫瘤細(xì)胞內(nèi)兩者相關(guān)性的研究少報道。在一項對早期乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+TILs的表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［22］。一項對180例乳腺癌患者組織微陣列的研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+iTILs表達(dá)與免疫細(xì)胞PD-L1表達(dá)具有相關(guān)性，而CD8+iTILs表達(dá)與腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)無相關(guān)性［21］。本研究顯示，CD8+iTILs表達(dá)與TC中PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.301，P=0.019）。浸潤的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌的干擾素（IFN）-γ是誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)所必需的［21］，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)可能是適應(yīng)性機(jī)制的結(jié)果［19］。因此，針對PD-L1的免疫治療，CD8+iTILs高表達(dá)患者可能具有較好的療效。然而抗PD-L1單藥治療的有效率只有5%～20%［18］，既然免疫檢查點抑制劑的應(yīng)用是以腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤為前提，在非LPBC中TILs數(shù)量較少，這可能是抗PD-L1治療有效率低的原因之一。我們在對LPBC的研究中發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)PD-L1和CD8+TILs的表達(dá)無相關(guān)性，這可能會降低該類患者PD-L1免疫治療的療效；隨著對LPBC中腫瘤和間質(zhì)PD-L1和CD8+TILs的表達(dá)進(jìn)行更深入的研究，可能有助于提高免疫治療的有效率。

綜上所述，間質(zhì)和瘤內(nèi)CD8+TILs對LPBC顯示不同的預(yù)后預(yù)測作用，CD8+iTILs表達(dá)與TC中PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，這可能是CD8+iTILs高表達(dá)患者預(yù)后差的原因之一，CD8+iTILs高表達(dá)的患者可能對PD-L1免疫抑制劑顯示更好的療效。PD-L1與一些與預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)相關(guān)，但與DFS和OS無顯著相關(guān)性。LPBC患者PD-L1陽性率較高，且預(yù)后較好；隨著對LPBC中PD-L1和CD8+TILs表達(dá)研究的深入，必將為乳腺癌的免疫治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突