楊文靜聶峰杰張麗劉璇鞏檑

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002)

植物液泡具有多方面的作用，包括維持滲透壓、細(xì)胞質(zhì)pH值和離子穩(wěn)態(tài)、保護(hù)植物抵抗環(huán)境脅迫、解毒、色素沉著和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些作用是通過(guò)定位在液泡膜上的許多蛋白質(zhì)協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中的質(zhì)子泵發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。植物細(xì)胞液泡膜上能量依賴的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)由2個(gè)H+泵驅(qū)動(dòng)：液泡(“V型”)H+-ATP酶(EC3.6.1.3)和H+-(焦磷酸鹽激發(fā))無(wú)機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase：EC3.6.1.1)。其中的無(wú)機(jī)焦磷酸酶是由AVP1(Arabidopsis Vacuolar Proton-pump 1)基因編碼，其cDNA序列由Sarafian V等于1992年在擬南芥中首次完整克隆[1]。

經(jīng)典研究認(rèn)為，AVP1是一種進(jìn)化保守的，廣泛存在于植物、原生動(dòng)物、細(xì)菌以及真菌中的H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶。在液泡膜上水解焦磷酸鹽(PPi)，不僅削弱PPi濃度過(guò)高對(duì)胞質(zhì)中生物大分子合成的影響，還可以用PPi水解產(chǎn)生的自由能催化H+由胞質(zhì)向液泡的運(yùn)輸，與液泡膜H+-ATPase一起建立跨液泡膜質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，為各種溶質(zhì)分子(如金屬離子和糖類)的跨液泡膜主動(dòng)運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力。

但最近也有研究表明，AVP1也可以定位于韌皮部的伴胞細(xì)胞質(zhì)膜上，在H+濃度梯度存在的情況下，“反向”合成焦磷酸鹽而發(fā)揮焦磷酸鹽合成酶的作用[2]。這種焦磷酸鹽合成酶作用能夠增強(qiáng)光合作用、韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)和向庫(kù)器官的運(yùn)送等促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一系列事件。

植物的生產(chǎn)力在很大程度上是由同化物在生產(chǎn)地點(diǎn)和利用地點(diǎn)之間的分配決定的。質(zhì)子泵焦磷酸酶(H+-PPase)參與植物的許多能量過(guò)程，包括一般生長(zhǎng)和生物量積累、CO2固定、養(yǎng)分獲取和脅迫響應(yīng)。

本文綜述了AVP1基因編碼蛋白在植物形態(tài)建成、響應(yīng)非生物脅迫和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累等方面的研究結(jié)果，重點(diǎn)介紹了其在旱、鹽、金屬離子耐受、元素利用效率、糖代謝等過(guò)程中發(fā)揮的作用及可能的機(jī)制，以及AVP1基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控方式。為AVP1基因的生理功能提供全面的梳理，也為利用基因工程技術(shù)手段利用其功能育種提供視角。

1 AVP1基因的主要功能

1.1 AVP1影響植物形態(tài)建成

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)、生殖器官形態(tài)是否正常發(fā)育、結(jié)構(gòu)有無(wú)畸變、數(shù)量多寡都是影響生物量、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要先決條件。許多研究都表明，AVP1能夠影響植物形態(tài)建成的多方面表現(xiàn)。

1.1.1 AVP1影響花粉發(fā)育

Sato M H等利用GUS-報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，在擬南芥H+-PPase的編碼基因AVP1的調(diào)控區(qū)域分離得到1個(gè)0.4Kb僅在花粉中有活性的區(qū)域。表明AVP1基因可以組織特異性的調(diào)控H+-PPase表達(dá)，并揭示了H+-PPase在花粉成熟過(guò)程中生物學(xué)意義[3]。

1.1.2 AVP1促進(jìn)胚胎發(fā)育

擬南芥H+-PPase和H+-ATPase同時(shí)敲除的突變體受精胚胎第1次分裂幾乎對(duì)稱的，而導(dǎo)致后續(xù)在胚胎發(fā)育的各個(gè)階段都形成了異常模式，并伴隨著子葉、根系、幼苗的發(fā)育缺陷而抑制生長(zhǎng)[4]。

1.1.3 AVP1維持葉的形態(tài)發(fā)育

實(shí)驗(yàn)證明，在擬南芥AVP1基因缺失突變體中，積累了過(guò)量的焦磷酸鹽(PPi)，植株表現(xiàn)出葉畸形、扁平細(xì)胞畸變、表皮缺陷、補(bǔ)償性細(xì)胞腫塊和葉脈畸形等葉片形態(tài)異常，進(jìn)而生長(zhǎng)遲緩[5]。而在AVP1過(guò)表達(dá)的擬南芥植株中，由于葉細(xì)胞數(shù)量增加而表現(xiàn)葉片數(shù)量和葉單面積增加[6]。

1.2 AVP1提高植物生物量、產(chǎn)量

生物量和產(chǎn)量是評(píng)價(jià)作物品種非常重要的性狀和考量，因此研究如何通過(guò)多種手段提高產(chǎn)量是育種家的關(guān)鍵課題。但常規(guī)育種工作量大、周期長(zhǎng)，而利用基因工程技術(shù)可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀的改良，因其目標(biāo)明確、周期短被越來(lái)越多的應(yīng)用于作物改良。隨之而來(lái)也有越來(lái)越多的科學(xué)家致力于發(fā)掘更多的、新的直接影響產(chǎn)量的主效基因，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)AVP1是一個(gè)可以顯著影響生物量和產(chǎn)量的基因。

在小麥中發(fā)現(xiàn)，AVP1能夠通過(guò)優(yōu)化碳的源-庫(kù)分配而增加產(chǎn)量，溫室和田間的AVP1轉(zhuǎn)基因小麥也獲得了更高的籽粒產(chǎn)量和單株種子數(shù)，且根系生物量有所增加[7]。轉(zhuǎn)AVP1基因的大麥由于莖面積的增加而產(chǎn)生更大的莖生物量，更重要的是與野生型相比，單株產(chǎn)量更高[8]。OsSIZ1/AVP1共同過(guò)表達(dá)的棉花植株在旱地條件下比野生型纖維含量更高、產(chǎn)量更高[9]。

1.3 AVP1提高植物對(duì)旱、鹽的耐受

干旱是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)積累的最重要因素之一，在全球變暖和目前農(nóng)業(yè)可用水資源普遍匱乏的背景下，水資源短缺日益加劇，干旱脅迫已經(jīng)成為非生物脅迫中影響植物生長(zhǎng)的最主要因素。植物抵抗和適應(yīng)干旱的途徑主要有節(jié)水保水，如植物葉片氣孔關(guān)閉和加快吸水，如降低滲透，滲透勢(shì)調(diào)節(jié)是植物抗旱性的主要機(jī)制。AVP1能夠利用水解焦磷酸產(chǎn)生的能量催化H+由胞質(zhì)像液泡運(yùn)輸形成的跨液泡膜質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為物質(zhì)運(yùn)輸和滲透勢(shì)調(diào)節(jié)提供了可能。

在楊樹(shù)、小麥、染色茜草、擬南芥和草坪草等多種植物中的研究都表明，AVP1過(guò)表達(dá)植株較野生型有更強(qiáng)的旱、鹽耐受性。過(guò)表達(dá)AVP1的甘蔗根系長(zhǎng)而豐富，與此同時(shí)能夠承受較高的鹽和旱脅迫[10]。過(guò)表達(dá)AVP1番茄根生物量增加并將Na+隔離到液泡中而減弱Na+積累的毒性作用，從而提高了番茄的旱、鹽脅迫[11]。在大麥中鑒定到了與鹽、旱耐受相關(guān)的AVP1位點(diǎn)。轉(zhuǎn)AVP1基因棉花植株耐鹽性較對(duì)照顯著提高。AVP1介導(dǎo)的棉花抗逆性增強(qiáng)的分子機(jī)制可能是，過(guò)表達(dá)AVP1似乎刺激生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，進(jìn)而刺激根的發(fā)育，較大的根系使AVP1過(guò)表達(dá)植株在干旱和鹽堿條件下更有效地吸收水分，從而提高了抗逆性和產(chǎn)量；由于液泡焦磷酸酶質(zhì)子泵的活性增強(qiáng)，生成一個(gè)高跨液泡膜質(zhì)子電化學(xué)梯度，導(dǎo)致液泡內(nèi)低水勢(shì)和更高的二次運(yùn)輸活動(dòng)，防止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累有毒離子[12]。鹽脅迫下的轉(zhuǎn)AVP1基因煙草長(zhǎng)勢(shì)更好、鮮重更大，是由于AVP1增強(qiáng)了液泡膜上的質(zhì)子電化學(xué)梯度，避免Na+在細(xì)胞質(zhì)中積累。同時(shí)，丙二醛和H2O2顯著低于野生型，表明AVP1能夠在鹽脅迫下發(fā)揮保護(hù)作用[13]。

1.4 AVP1提高重金屬元素的耐受

面對(duì)土壤中廣泛存在的重金屬污染，植物自身具備相應(yīng)的機(jī)制以便在低濃度元素條件下提高利用效率,在高濃度條件下減少積累量來(lái)維持正常生長(zhǎng)。提高一些離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量就是這些機(jī)制中的一種，AVP1的跨液泡膜驅(qū)動(dòng)力可以為離子轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，可能在離子脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

植物對(duì)重金屬的耐受策略之一是將重金屬隔離在液泡中，小麥中分離得到的TaVP1轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草在銅脅迫下表現(xiàn)出更強(qiáng)的根系、更大的生物量、更少的葉綠素?fù)p失和更高的銅積累量[14]?；诖?lián)質(zhì)粒標(biāo)記(TMT)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析了低鎘積累量和高鎘積累量2種水稻發(fā)現(xiàn)25個(gè)與低鎘積累相關(guān)的蛋白，其中包括液泡H+焦磷酸酶1(OVP1)。過(guò)表達(dá)OVP1降低了水稻地上部分的鎘濃度，促進(jìn)了水稻生長(zhǎng)，表明OVP1在水稻鎘積累中發(fā)揮重要作用[15]。硼是植物必需的微量元素，具有減輕重金屬毒害的作用。硼對(duì)西瓜釩耐受性的改善作用是基于硼的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抗氧化防御系統(tǒng)的改善，其中根細(xì)胞液泡中釩的排除量是由H+-ATPase、H+-PPase活性的提高和VHP1等基因的轉(zhuǎn)錄水平升高而驅(qū)動(dòng)的[16]。

1.5 AVP1參與植物糖代謝

種子植物的發(fā)芽后生長(zhǎng)需要特殊的代謝，如糖異生，以支持幼苗的異養(yǎng)生長(zhǎng)，直到功能光合器官建立。但擬南芥avp1突變體在萌發(fā)后無(wú)法支持異養(yǎng)生長(zhǎng)，與野生型相比，下胚軸伸長(zhǎng)在黑暗中嚴(yán)重受損、焦磷酸(PPi)水平高2.5倍。因此，AVP1在植物體內(nèi)的主要功能是對(duì)胞質(zhì)PPi的水解，植物細(xì)胞通過(guò)消除細(xì)胞質(zhì)中的PPi來(lái)優(yōu)化其代謝功能，以實(shí)現(xiàn)胚胎后異養(yǎng)生長(zhǎng)[17]。

在柑橘中鑒定到3個(gè)焦磷酸酶基因CsVPP-1、CsVPP-2、CsVPP-4，且在7個(gè)柑橘品種果實(shí)中I型V-PPase基因的轉(zhuǎn)錄水平與蔗糖呈顯著正相關(guān)。過(guò)表達(dá)I型V-PPase基因顯著提高了PPase活性，降低了焦磷酸鹽含量，增加了蔗糖含量。因此，CsVPP-1和CsVPP-2在液泡中蔗糖的儲(chǔ)存發(fā)揮關(guān)鍵作用，不僅通過(guò)調(diào)節(jié)焦磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，最終還通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平與蔗糖生物合成和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因相關(guān)[18]。

植物的適應(yīng)和脅迫響應(yīng)依賴于源庫(kù)器官碳平衡的動(dòng)態(tài)優(yōu)化。到目前為止，對(duì)如何控制速率的分子機(jī)制的研究主要集中在負(fù)責(zé)將蔗糖裝載到葉脈韌皮部篩管元件-伴生細(xì)胞復(fù)合物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。最近，對(duì)擬南芥的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析確定了AVP1對(duì)于控制糖出口速率的調(diào)控作用[19]。

1.6 AVP1提高元素利用效率

氮(N)、磷(P)、鉀(K)等是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，缺乏這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將會(huì)嚴(yán)重限制作物生長(zhǎng)、坐果、果實(shí)發(fā)育及產(chǎn)量，生產(chǎn)實(shí)踐中需要定期施肥以獲得高產(chǎn)和防止土壤退化。但肥料的低效利用增加了成本和污染，因此深入解析高效利用肥料的品種對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

過(guò)表達(dá)擬南芥H(+)-PPase基因的生菜對(duì)15N標(biāo)記肥料的積累明顯高于對(duì)照植株，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的根系生長(zhǎng)也更旺盛[20]。番茄中過(guò)表達(dá)AVP1基因，能夠在缺磷條件下增加25%的單株可售成熟果實(shí)；且在低磷條件下，AVP1過(guò)表達(dá)番茄植株從葉片(源)到果實(shí)(庫(kù))的磷轉(zhuǎn)運(yùn)增加；溫室和大田試驗(yàn)中，AVP1過(guò)表達(dá)植株的移栽成活率比對(duì)照植株高11%[21]。披堿草中鑒定到的v型H+-焦磷酸酶基因EdVP1基因，在2個(gè)小麥品種中過(guò)表達(dá)EdVP1。連續(xù)2a的試驗(yàn)結(jié)果表明，EdVP1顯著提高了轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)量和鉀利用效率。盆栽實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的芽和根明顯更長(zhǎng)，鉀離子流入和氫離子流出也更高[22]。

1.7 反向合成焦磷酸

焦磷酸酶通過(guò)水解焦磷酸鹽而部分介導(dǎo)植物能量分配和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)是已被證實(shí)的典型作用，但也有研究表明焦磷酸酶可以作為焦磷酸合酶發(fā)揮作用。

H+-PPase突變株系擬南芥液泡的向內(nèi)電流明顯減少，而高表達(dá)H+-PPase的液泡中明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)與反向H+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的電流振幅取決于膜電位、胞漿Pi濃度和整個(gè)液泡pH梯度的大小[23]。另一個(gè)過(guò)表達(dá)AVP1基因擬南芥擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株積累了更多的地上和根系生物量、韌皮部卸載和運(yùn)輸能力增強(qiáng)。研究者認(rèn)為，焦磷酸酶定位于質(zhì)膜，而非液泡膜，AVP1基因過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的生長(zhǎng)增強(qiáng)是由于其在韌皮部伴生細(xì)胞中發(fā)揮PPi合成酶的功能[24]。

2 AVP1基因的主要調(diào)控方式

2.1 蛋白相互作用

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白存在時(shí)，AVP1的酶活性和質(zhì)子泵活性增加、在高濃度PPi條件下對(duì)AVP1提供保護(hù)、高溫條件下提高AVP1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、減輕Na+對(duì)AVP1的傷害，也鑒定到了AVP1與14-3-3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)[25]。AVP1作為Na+/H+交換器是維持Na+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，在番茄中的研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)蛋白SlCBL10突變體葉片Na+積累能力下降，導(dǎo)致從木質(zhì)部上傳的Na+較低，使有毒離子到達(dá)頂端和花[26]。說(shuō)明AVP1是處于下游位置作為上游調(diào)控蛋白的靶位點(diǎn)而發(fā)揮作用，并影響生長(zhǎng)發(fā)育事件。

2.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，花粉發(fā)育受到轉(zhuǎn)錄激活因子AtCAMTA1和AtCAMTA5以及AtVOZ1和AtVOZ2的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄激活因子能夠結(jié)合在AVP1基因啟動(dòng)子區(qū)一個(gè)38bp的特異的順式作用區(qū)，激活A(yù)VP1基因的表達(dá)而影響花粉發(fā)育過(guò)程[27]。

2.3 翻譯后調(diào)控

擬南芥中的研究表明，AVP1的高表達(dá)提高了焦磷酸依賴的質(zhì)子泵活性、耐鹽性、根毛發(fā)育等；但在過(guò)表達(dá)AVP1的SOS1功能缺失突變體中，這些表型受到負(fù)性影響[28]。表明AVP1蛋白水平的提高需要SOS1參與，并且這種調(diào)控似乎是翻譯后的，通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，確定了幾個(gè)可能調(diào)控亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和活性的磷酸化、泛素化和素泛素化靶位點(diǎn)。

3 展望

AVP1基因編碼的無(wú)機(jī)焦磷酸酶是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和原生動(dòng)物的獨(dú)特H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶。在液泡膜上，H+-PPase能將PPi水解為2個(gè)Pi，不僅削弱PPi濃度過(guò)高對(duì)胞質(zhì)中生物大分子合成的影響，還可以用PPi水解產(chǎn)生的自由能，催化H+由胞質(zhì)向液泡的運(yùn)輸，與液泡膜H+-ATPase一起建立跨液泡膜質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，為各種溶質(zhì)分子(如陽(yáng)離子、元素、糖類等)的跨液泡膜主動(dòng)運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力。焦磷酸酶以經(jīng)典水解焦磷酸和“反向”合成焦磷酸功能在植物形態(tài)建成、糖積累、元素利用效率、產(chǎn)量及旱、鹽、金屬離子脅迫等過(guò)程中發(fā)揮積極作用。其表達(dá)和功能發(fā)揮已發(fā)現(xiàn)可通過(guò)蛋白相互作用、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后調(diào)控等方式，對(duì)于基因的開(kāi)發(fā)利用具有一定的借鑒意義。

雖然在多種植物中都證明了焦磷酸酶對(duì)于生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵作用，但其具體機(jī)制和參與的信號(hào)通路沒(méi)有完善，一定程度上影響了焦磷酸酶基因的利用。如，經(jīng)典的水解焦磷酸功能和“反向”合成焦磷酸功能分別觸發(fā)的具體調(diào)控通路，水解與合成的觸發(fā)機(jī)制，以及水解-合成的穩(wěn)態(tài)維持策略。這些問(wèn)題還有待研究者深入研究以完善焦磷酸酶調(diào)控機(jī)制的理論，從而為在植物中通過(guò)生物技術(shù)手段利用焦磷酸酶基因提供理論支撐。