田海霞，孫婷婷，李 頌，馬 躍，劉海新，戴 申，翁慧瓊

1. 中茶科技（北京）有限公司，北京 102209；2. 云南中茶茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650000

普洱熟茶是利用云南大葉種曬青毛茶經(jīng)潮水、渥堆發(fā)酵、晾干、精制后得到的后發(fā)酵茶[1]。普洱熟茶渥堆發(fā)酵過(guò)程本質(zhì)上是曬青毛茶在一定的溫濕度和含氧量的環(huán)境條件下，伴隨菌群的更替和代謝[2-3]，形成豐富的外源胞外酶并誘導(dǎo)激活茶葉內(nèi)源酶，進(jìn)而發(fā)生物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化，期間伴隨微生物對(duì)葉片的侵染作用[4]、各種酶促反應(yīng)及美拉德反應(yīng)，最終形成普洱熟茶的典型特征。渥堆發(fā)酵是普洱熟茶的特征性核心工序[5]，目前對(duì)普洱熟茶渥堆發(fā)酵工序的研究集中在茶青初始及過(guò)程中水分變化、渥堆高度、發(fā)酵進(jìn)程的堆溫變化、人工翻堆次數(shù)及渥堆發(fā)酵進(jìn)程中微生物菌群的變化分析與優(yōu)勢(shì)菌株研究[6-9]。但優(yōu)勢(shì)菌株通過(guò)人工干預(yù)來(lái)推動(dòng)發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)而影響發(fā)酵底物的香氣和滋味的研究較少，與自動(dòng)化固態(tài)發(fā)酵裝備結(jié)合進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)業(yè)應(yīng)用推廣的研究仍處于空白[10-12]。本試驗(yàn)研究將前期大量工藝應(yīng)用研究中篩選的普洱傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行重新組合，制備成散茶曲，引入小罐標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)酵工藝，研究散茶曲對(duì)普洱熟茶發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株來(lái)源：新黑曲霉（Aspergillus neoniger），保藏編號(hào)為CGMCC No.15883，從勐海地區(qū)傳統(tǒng)大堆發(fā)酵一翻料中分離篩選得到；琉球曲霉（Aspergillus luchuensis），保藏編號(hào)為CGMCC No.15663，從勐海地區(qū)傳統(tǒng)大堆發(fā)酵三翻料中分離篩選得到；魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii），保藏編號(hào)為CICC 1379，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），保藏編號(hào)為CGMCC No.15959，從傳統(tǒng)發(fā)酵的開(kāi)溝起堆料及老茶中分離篩選得到。

試劑耗材：云南布朗產(chǎn)區(qū)大葉種曬青毛茶，購(gòu)于中茶云南公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB），購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室自制，ThermoFisher F3型單道移液器；一次性培養(yǎng)皿、接種環(huán)等。

1.2 儀器與設(shè)備

蘇凈SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)；上海一恒GRX-9013A型恒溫恒濕培養(yǎng)箱；ZEALWAY GR650R型高壓滅菌鍋；2834型水浴鍋；Mettler Toledo ME104型萬(wàn)分之一天平；上海恒一DHG-9240A型電熱恒溫干燥箱；蔡司GR85DA型顯微鏡；Kylin-Bell VORTEX QL-902 型渦旋混合器；IKA RCT B S025 型加熱磁力攪拌器等。發(fā)酵小罐采用自主研發(fā)茶葉發(fā)酵專用罐，為食品級(jí)HP450J材質(zhì)制作，發(fā)酵罐容積為4 L，濕茶填裝量為 1 ～ 1.5 kg，發(fā)酵小罐裝置見(jiàn)圖 1。

圖1 發(fā)酵小罐裝置圖Figure 1 fermentation small tank device diagram

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 散茶曲制備

以云南大葉種條茶為培養(yǎng)基質(zhì)，將其滅菌后接入普洱茶分離篩選的優(yōu)勢(shì)菌株[13-17]，分別為琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、新黑曲霉（Aspergillus neoniger)、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的液體種子，經(jīng)固態(tài)純種培養(yǎng)后形成散茶純種，按一定比例拼配后形成發(fā)酵用散茶曲，散茶曲活菌數(shù)≥108CFU/g。發(fā)酵用散茶曲拼配見(jiàn)表1。

表1 散茶曲種混合配方表Table 1 Mixed formula table of Loose tea

1.3.2 散茶曲發(fā)酵普洱熟茶方法

按照?qǐng)D2的工藝流程，取五級(jí)曬青毛茶共9份，每份100 kg，各加水42 kg，充分拌勻后靜置20 min，取其中8份分別按表1播撒編號(hào)1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#的散茶曲，最后1份不播撒散茶曲作為對(duì)照（CK）樣；每份播撒量為干茶的10%即10 kg，充分拌勻后靜置20 min，取樣測(cè)水分并做記錄，使茶葉的含水量控制在33% ～ 35%；復(fù)水后的處理樣用小罐封裝，每罐裝量為1.2 kg濕茶，每個(gè)處理裝130罐，獨(dú)立碼放形成兩個(gè)堆垛。將發(fā)酵堆垛按順序碼放在發(fā)酵室進(jìn)行發(fā)酵，按表2的要求設(shè)置培養(yǎng)室的環(huán)境參數(shù)，發(fā)酵全程不補(bǔ)水、不出料、不翻動(dòng)，一次性培養(yǎng)35 d后結(jié)束發(fā)酵；結(jié)束發(fā)酵的堆垛按處理標(biāo)記，將物料從小罐中倒出并解散后進(jìn)入干燥房干燥處理。

圖2 散茶曲小罐發(fā)酵普洱熟茶工藝流程Figure 2 Process flow of loose tea koji fermenting Pu'er ripe tea

表2 發(fā)酵室環(huán)境條件Table 2 Fermentation conditions

1.3.3 茶樣感官評(píng)定

發(fā)酵過(guò)程需要進(jìn)行兩次取樣審評(píng)，一次在發(fā)酵結(jié)束后，取樣開(kāi)湯，主要評(píng)價(jià)湯色和葉底狀態(tài)是否達(dá)到熟茶標(biāo)準(zhǔn)；第二次是干燥后，按茶葉審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行外形和內(nèi)質(zhì)審評(píng)，綜合打分評(píng)價(jià)發(fā)酵效果。

1.3.4 茶樣理化檢測(cè)

發(fā)酵結(jié)束后的各處理樣分別抽取2 kg進(jìn)行干燥，將水分統(tǒng)一調(diào)整至15%，分別進(jìn)行茶湯固形物、茶多酚、茶色素、pH值、氨基酸態(tài)氮和菌落總數(shù)測(cè)定。

水分測(cè)定方法參照 GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》測(cè)定；感官審評(píng)參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》進(jìn)行；茶湯固形物檢測(cè)方法參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中可溶性固形物測(cè)定方法（折光計(jì)法）；茶多酚檢測(cè)方法參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法》；茶褐素含量測(cè)定參照《茶學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)》[18]；pH值檢測(cè)方法參照《不同茶類茶湯pH值的研究》[19]；氨基酸態(tài)氮檢測(cè)方法參照GB 5009.235—2016第一種；菌落總數(shù)參照GB4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理茶樣感官評(píng)價(jià)結(jié)果

添加散茶曲的不同處理綜合評(píng)分排名為：7#、8#、6#、5#、1#、2#、3#、4# 和 CK#（ 表3）。其中，接入散茶曲處理的發(fā)酵效果均優(yōu)于不添加散茶曲，接入混合散茶曲的茶樣感官品質(zhì)優(yōu)于接入單菌株散茶曲的茶樣。在接入混合散茶曲處理的審評(píng)結(jié)果中，5#處理的發(fā)酵料稍有結(jié)塊，香氣中稍帶霉味和水汽感；6#處理的發(fā)酵料外形松散，焦甜香高揚(yáng)，湯色明亮，滋味略帶苦，葉底稍硬（發(fā)酵稍過(guò)）；7#處理的發(fā)酵料外形松散，干茶紅潤(rùn)度好，香氣高揚(yáng)，滋味醇厚，葉底柔軟有彈性；8#處理的發(fā)酵料外形松散，干茶紅潤(rùn)度好，香氣高揚(yáng)，滋味濃醇，湯色稍渾濁。綜合審評(píng)結(jié)果可看出：隨著琉球曲霉添加比例的上升，茶葉外形的松散度和干茶的紅潤(rùn)度明顯變好，香氣高揚(yáng)，但湯色逐步變渾濁；隨著新黑曲霉添加比例的上升，新黑曲霉對(duì)茶湯的透亮度有明顯的改善作用，但發(fā)酵料容易結(jié)塊（圖3）。因此，新黑曲霉和琉球曲霉對(duì)發(fā)酵料感官審評(píng)影響明顯，推斷其在發(fā)酵進(jìn)程中起主導(dǎo)作用，酵母菌和枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵料的感官品質(zhì)影響表現(xiàn)不突出，推斷其在發(fā)酵進(jìn)程中起輔助作用。

圖3 不同處理的干茶Figure 3 Dried tea under different treatments

表3 不同處理發(fā)酵茶樣感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation different experimental fermented tea samples

2.2 不同處理茶樣發(fā)酵成熟度變化

從圖4可看出：1#處理和5#處理在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)發(fā)酵成熟度最高，可達(dá)8成熟；6#處理和7#處理的成熟度為7成熟，其它接散茶曲的處理和CK對(duì)照樣的成熟度為6成熟。結(jié)合審評(píng)結(jié)果來(lái)看：成熟度達(dá)到8成時(shí)，葉底稍硬略有腐爛，發(fā)酵稍過(guò)；成熟度達(dá)到7成時(shí)，感官品質(zhì)更佳；而成熟度為6成時(shí)，苦底稍重，湯色的透亮度下降。從成熟度表現(xiàn)來(lái)看，新黑曲霉可明顯加速發(fā)酵進(jìn)程，隨著新黑曲霉散茶曲種添加比例的下降，發(fā)酵的成熟度也隨之下降。

圖4 不同處理樣發(fā)酵料發(fā)酵度Figure 4 Different processing sample fermentation material fermentation degree

2.3 不同處理茶樣理化指標(biāo)變化

從表4可看出，不添加散茶曲種的對(duì)照CK樣茶色素、pH值、氨基酸態(tài)氮和固形物的含量均明顯低于同發(fā)酵條件下的添加散茶曲的處理樣?；旌仙⒉枨幚順又?，隨著新黑曲霉添加比例的降低，茶多酚含量逐步升高，茶色素、pH值、氨基態(tài)氮和固形物含量變化不大。鑒于熟茶后期存儲(chǔ)轉(zhuǎn)化空間的考慮，兼顧感官審評(píng)結(jié)果，優(yōu)選茶多酚保留大的處理，因此以7#處理最佳。

表4 不同處理發(fā)酵茶樣理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 4 Different experimental fermented tea sample physical and chemical indicators testing table

2.4 不同處理茶樣發(fā)酵過(guò)程中微生物菌落的變化

從表5可看出，CK、2#、3#、4#和8#等五個(gè)處理的霉菌菌落數(shù)量過(guò)少，第一階段結(jié)束后菌絲漲勢(shì)弱，作用不充分，致使第二階段濕熱作用時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)部水分散失過(guò)快，接入的酵母菌和芽孢桿菌活菌數(shù)急速下降，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，使發(fā)酵結(jié)束后的物料湯色渾濁，成熟度稍低。1#和5#處理，第一階段霉菌生長(zhǎng)過(guò)多，微生物呼吸產(chǎn)生大量水分迅速累計(jì)至發(fā)酵罐底部，出現(xiàn)底部積水，致使第二階段濕熱發(fā)酵過(guò)快，底部出現(xiàn)輕微碳化，導(dǎo)致發(fā)酵后的物料結(jié)塊嚴(yán)重，白色菌絲過(guò)多，湯色濃度不夠，葉底碳化嚴(yán)重，茶湯苦底重，香氣沉悶水汽大。6#和7#處理，第一發(fā)酵階段菌落數(shù)量適中，發(fā)酵菌絲滿布且均勻，成團(tuán)但不腐爛，底部無(wú)積水；第二階段的濕熱發(fā)酵均勻充分，干茶紅潤(rùn)，發(fā)酵成熟度適中；第三階段養(yǎng)瓶期間出現(xiàn)甜醇感和梅子香，葉底柔軟不腐爛，香氣高揚(yáng)。綜上微生物菌落數(shù)的表現(xiàn)看，發(fā)酵前期的霉菌菌落數(shù)需要快速達(dá)到108數(shù)量級(jí)以上，菌絲要充分侵染茶葉，使茶葉液泡中的多酚氧化酶充分釋放，同時(shí)各類微生物要充分釋放胞外酶，為后續(xù)濕熱作用提供酶活動(dòng)力[20]?？梢?jiàn)，本試驗(yàn)中5#、6#和7#處理的添加量和配比可達(dá)到上述效果。

表5 不同處理發(fā)酵過(guò)程中微生物菌落變化表Table 5 Changes of microbial colonies in different experimental groups during fermentation

3 討論與結(jié)論

通過(guò)接種不同配比的散茶曲進(jìn)行小罐普洱熟茶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，綜合分析了不同處理發(fā)酵料感官品質(zhì)特征、理化指標(biāo)變化趨勢(shì)及發(fā)酵進(jìn)程中微生物菌落數(shù)量的變化情況。從不同處理樣的感官審評(píng)結(jié)果可知：當(dāng)魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例固定時(shí)，新黑曲霉和琉球曲霉的添加比例在3∶4時(shí)發(fā)酵的狀態(tài)最佳，可兼顧滋味、香氣、湯色和外形，有效降低茶葉發(fā)酵過(guò)程結(jié)塊現(xiàn)象，降低新堆的霉味和水悶氣，提升茶葉品質(zhì)，出現(xiàn)特征性的梅子香氣。從不同處理樣的理化檢測(cè)數(shù)據(jù)可看出：按比例添加散茶曲種發(fā)酵普洱熟茶，茶色素含量明顯提升，茶色素對(duì)調(diào)節(jié)人體腸道菌群有很好的輔助作用[21-23]；茶湯pH值明顯升高，達(dá)到人體液體[24]的弱堿性水平；茶湯固形物含量明顯增加，提升茶湯的醇厚度；茶湯中氨基態(tài)氮含量提升，使茶湯的鮮甜感更突顯。從不同微生物的發(fā)酵表現(xiàn)來(lái)看：新黑曲霉對(duì)普洱熟茶發(fā)酵作用力最強(qiáng)，可加速發(fā)酵進(jìn)程，但新黑曲霉發(fā)酵使茶多酚消耗過(guò)大，影響熟茶后期存放轉(zhuǎn)化空間，且發(fā)酵料容易積水結(jié)塊，使最終產(chǎn)品霉味和水悶氣重。琉球曲霉作用過(guò)于溫和，對(duì)茶葉的侵染力較弱，致使后期發(fā)酵不充分導(dǎo)致茶湯渾濁，但發(fā)酵料香氣高揚(yáng)，外形完整，干茶紅潤(rùn)不結(jié)塊。魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌在第一階段擴(kuò)增繁殖期很容易被環(huán)境及茶葉自帶的微生物菌群壓制，對(duì)發(fā)酵進(jìn)程和發(fā)酵效果的表現(xiàn)并不明顯。

綜上所述，接入散茶曲可明顯加快普洱熟茶的發(fā)酵進(jìn)程。其中，新黑曲霉對(duì)發(fā)酵速度和湯色的亮度貢獻(xiàn)最大，琉球曲霉對(duì)外形的紅潤(rùn)度和松散度影響明顯，魯氏酵母菌和枯草芽孢桿菌對(duì)后熟過(guò)程中風(fēng)味的醇化和滋味的豐富度有輔助作用。通過(guò)四種微生物配比的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)新黑曲霉：琉球曲霉：魯氏酵母：枯草芽孢桿菌配比為3∶4∶2∶1時(shí)發(fā)酵的效果最佳，其發(fā)酵成熟度為7成，茶湯中的茶多酚和茶色素的比例適中，更有利于后期陳化轉(zhuǎn)化，此時(shí)的茶湯pH值、氨基酸態(tài)氮和水溶性固形物的含量也較高，茶湯滋味更飽滿豐富。因此，適當(dāng)?shù)纳⒉枨砑颖壤杉铀侔l(fā)酵進(jìn)程，優(yōu)化發(fā)酵料感官品質(zhì)，提升發(fā)酵料的功能性理化成分含量。本試驗(yàn)對(duì)小罐標(biāo)準(zhǔn)化熟茶的推廣和應(yīng)用具有指導(dǎo)作用，可通過(guò)微生物優(yōu)勢(shì)菌株的干預(yù)和發(fā)酵控制條件改變[24]，從而控制發(fā)酵成熟度和產(chǎn)品風(fēng)味特色，優(yōu)化功能性理化成分指標(biāo)，進(jìn)一步推動(dòng)普洱熟茶發(fā)酵的工業(yè)化水平，提升產(chǎn)品的健康屬性，打造產(chǎn)品的差異化特性。

微生物發(fā)酵可使曬青毛茶重塑，不同的微生物配比配合發(fā)酵工藝的適當(dāng)調(diào)整可在一定程度上實(shí)現(xiàn)差異化發(fā)酵。本試驗(yàn)引入的小罐發(fā)酵技術(shù)是人工散茶曲干預(yù)研究普洱熟茶發(fā)酵的新載體，每個(gè)發(fā)酵小罐可實(shí)現(xiàn)內(nèi)部微環(huán)境的相對(duì)獨(dú)立，同一培養(yǎng)室可同時(shí)嘗試多種微生物的組合搭配，而相互間不受影響，工業(yè)化操作的便利性也更好。

小罐發(fā)酵技術(shù)是傳統(tǒng)熟茶發(fā)酵工藝技術(shù)的升級(jí)，小罐發(fā)酵的本質(zhì)是把大堆料進(jìn)行分割，變成若干個(gè)獨(dú)立單元，通過(guò)外置自動(dòng)化裝備，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的自動(dòng)化和連續(xù)化作業(yè)，每個(gè)發(fā)酵罐單獨(dú)控制，獨(dú)立完成發(fā)酵，每個(gè)培養(yǎng)房可看作一個(gè)發(fā)酵大堆，可容納 10 ～ 20 t的發(fā)酵小罐料，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)房的環(huán)境條件，滿足發(fā)酵小罐的溫濕度要求，小罐罐心溫度和環(huán)境溫度可控制在2℃ ～ 3℃的溫差范圍，因此發(fā)酵全程不倒罐、不出罐，一次性完成發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)每個(gè)小罐罐體內(nèi)部的環(huán)境相對(duì)封閉，且能充分保障發(fā)酵的均勻度和底物茶葉條索的完整性。

本實(shí)驗(yàn)在小罐發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上引入散茶曲，研究了散茶曲的制備方法，最優(yōu)發(fā)酵組合及散茶曲對(duì)發(fā)酵料品質(zhì)的影響。但散茶曲在發(fā)酵進(jìn)程中如何對(duì)底物茶葉發(fā)揮作用的研究還不夠深入，后續(xù)研究中，可重點(diǎn)關(guān)注小罐發(fā)酵過(guò)程中曲霉類對(duì)底物的影響，發(fā)酵環(huán)境和微生物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系及發(fā)酵過(guò)程中微生物、底物和環(huán)境三者相互作用的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)小罐發(fā)酵過(guò)程的精準(zhǔn)控制和差異化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。這對(duì)普洱熟茶發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)一步提升和品質(zhì)把控有著深遠(yuǎn)的影響，也對(duì)整個(gè)普洱熟茶發(fā)酵行業(yè)進(jìn)一步工業(yè)化轉(zhuǎn)型升級(jí)提供理論基礎(chǔ)。