胡波，孔君南，翟祥寧，劉小宇，于豪冰，劉李娜

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）屬于弧菌科弧菌屬，革蘭氏陰性桿菌，是海洋中的無(wú)聲殺手。VV 在水體環(huán)境中廣泛分布，自然生長(zhǎng)于水溫15～27 ℃的港灣、河海交界處及內(nèi)陸鹽湖水域的浮游生物、沉積物和貝類(lèi)中，或者寄生于牡蠣、蛤蜊、蝦蟹等海產(chǎn)品中。人類(lèi)通過(guò)食用被該菌污染的海產(chǎn)品或因傷口接觸該菌導(dǎo)致感染，從而導(dǎo)致壞死性筋膜炎、敗血癥和急性胃腸炎等。每年在我國(guó)東南沿海都有散發(fā)病例報(bào)道，感染率較低，但病情兇猛，死亡率高［1］。由于發(fā)病率較低，海洋弧菌并不是臨床主要的病原菌，易被忽視。當(dāng)今全球氣候變暖，海水溫度升高，使弧菌的分布范圍擴(kuò)大以及其致病因子表達(dá)上調(diào)，致病性增強(qiáng)，細(xì)菌開(kāi)始出現(xiàn)爆發(fā)高峰期，導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)弧菌疾病爆發(fā)。同時(shí)，當(dāng)下我國(guó)海軍訓(xùn)練和保障任務(wù)日益增多，在執(zhí)行各種遠(yuǎn)洋航行任務(wù)時(shí)，受傷或食用被弧菌污染的海產(chǎn)品，均有可能使海洋中存在的條件致病菌（主要是弧菌類(lèi)）進(jìn)入人體，引發(fā)嚴(yán)重感染，造成戰(zhàn)斗力減損［2］。值得注意的是，海洋弧菌感染具有起病急、病程短、病死率高的特點(diǎn)，目前沒(méi)有特效藥，臨床上往往會(huì)采用廣譜抗生素進(jìn)行治療［3］。但廣譜抗生素的使用，易造成菌群失調(diào)，誘發(fā)二次感染。因此，從備戰(zhàn)的角度出發(fā)，需要重視海洋弧菌對(duì)海軍官兵的健康隱患問(wèn)題。本研究通過(guò)前期文獻(xiàn)調(diào)研［4-5］，從中藥成分中確定了24 種抗菌有效成分，擬通過(guò)本研究，從中篩選對(duì)海洋弧菌有特殊抑制作用的成分，為治療海洋弧菌感染提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 24 種中藥單體及試劑 黃芩苷、黃芩素、β-桉葉醇、石吊蘭素、桑色素、槲皮素、木樨草素、二氫楊梅素、白楊素、芹菜素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、藥根堿、苦參堿、氧化苦參堿、鹽酸白屈菜紅堿、齊墩果酸、綠原酸、大黃素甲醚、異丁酰紫草素、穿心蓮內(nèi)酯、二氫丹參酮I、雷公藤紅素、丁香酚、鹽酸左氧氟沙星購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（純度HPLC≥98%）。腦心浸肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Mueller-Hinton（MH）肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，圓紙片（直徑10 mm）和DMSO 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

24 種中藥單體均為成品干粉，實(shí)驗(yàn)時(shí)溶解于0.01%DMSO 中，根據(jù)需要配制不同的濃度。

1.1.2 菌株 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，VA）ATCC17749、海洋創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）ATCC27562、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）ATCC17802 購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）ATCC27853、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922 由海軍特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 中藥單體化合物抑制弧菌生長(zhǎng)作用的初篩 采用紙片法［6］對(duì)24 種化合物單體的抗弧菌活性進(jìn)行初篩。基本方法為：吸取保存于甘油管中的指示菌儲(chǔ)備液各100 μl，到新鮮的腦心浸肉湯培養(yǎng)基中，28℃，在搖床中以130 r/min 活化24 h；吸取活化的指示菌液100 μl，涂布于腦心浸瓊脂平板上；吸取各樣品溶液20 μl（1 mg/ml），滴加于滅菌圓紙片（φ10 mm）上，待溶劑揮發(fā)后，分別貼于涂有指示菌液的平板上，倒置于28℃恒溫箱培養(yǎng)，16～18 h 觀察結(jié)果。各化合物單體預(yù)先配制成1 mg/ml 的溶液，以溶劑0.01%DMSO 為陰性對(duì)照，鹽酸左氧氟沙星（100 μg/ml）為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 化合物最低抑菌濃度測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法［7］，計(jì)算初篩有活性的樣品的最低抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC）。具體操作為：（1）MIC 板制備。無(wú)菌環(huán)境下，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96 孔聚苯乙烯板，第1～9 孔加藥液，每孔10 μl，第10 孔不加藥，為生長(zhǎng)對(duì)照，第11 孔為溶劑對(duì)照，此時(shí)濃度為1 280、640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml；（2）接種物制備，用MH 肉湯培養(yǎng)基活化相應(yīng)指示菌，28 ℃，在搖床中以130 r/min 活化24 h，將活化液用滅菌的MH 肉湯按照1∶1 000 稀釋后，加入到MIC 板，每孔加入100 μl，然后放入35℃普通空氣孵箱中培養(yǎng)16～20 h 觀察結(jié)果。以鹽酸左氧氟沙星為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 化合物抗菌譜研究 對(duì)1.2.2 中抑菌活性明確的單體化合物進(jìn)行擴(kuò)大的抗菌譜研究，采用4 種臨床常用質(zhì)控菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和大腸桿菌作為指示菌株，計(jì)算各化合物對(duì)于以上菌株的MIC，以鹽酸左氧氟沙星為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和均值的分析。

2 結(jié)果

2.1 24 種中藥單體化合物的抗菌活性初篩結(jié)果

結(jié)果顯示，24 種中藥單體化合物對(duì)溶藻弧菌VA 均無(wú)抑制作用，石吊蘭素、芹菜素、鹽酸白屈菜紅堿和雷公藤紅素對(duì)VV 和VP 有不同程度的抑制作用，雷公藤紅素抑菌作用最強(qiáng)，其次為鹽酸白屈菜紅堿。見(jiàn)表1。

表1 中藥單體化合物對(duì)弧菌的抑制作用（± s）

表1 中藥單體化合物對(duì)弧菌的抑制作用（± s）

注：VV 為創(chuàng)傷弧菌，VP 為副溶血弧菌；紙片直徑為10 mm；樣品濃度為1 mg/ml，鹽酸左氧氟沙星濃度為100 μg/ml

樣品名稱(chēng)石吊蘭素芹菜素鹽酸白屈菜紅堿雷公藤紅素鹽酸左氧氟沙星抑菌圈直徑（mm）VV 11.9±0.29-17.3±0.12 18.1±0.26 24.5±0.35 VP 11.9±0.26 14.3±0.29 16.03±0.32 18.2±0.1 23.1±0.25

2.2 化合物抑制弧菌的MIC

采用微量肉湯稀釋法，對(duì)通過(guò)紙片法篩選獲得的抑制海洋弧菌的4 種有效成分進(jìn)行了MIC 測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 中藥單體化合物對(duì)海洋弧菌的MIC（μg/ml）

從結(jié)果中可以看出，雷公藤紅素和鹽酸白屈菜紅堿抑菌作用強(qiáng)，其抑制VV 的MIC 均為1 μg/ml，折合物質(zhì)的量濃度分別為2.2 μmol/L 和2.6 μmol/L；對(duì)VP 的MIC 分別為0.5 μg/ml 和1 μg/ml，折合物質(zhì)的量濃度分別為1.1 μmol/L 和2.6 μmol/L。因石吊蘭素和芹菜素MIC＞128 μg/ml，抑制作用比較弱，因此選擇鹽酸白屈菜紅堿和雷公藤紅素進(jìn)行接下來(lái)的化合物抑菌譜研究。

2.3 化合物抑菌譜研究

由于2 種化合物的抑菌活性未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用臨床質(zhì)控菌株，對(duì)本次篩選獲得的2 種化合物進(jìn)行了抑菌譜研究。結(jié)果表明，2 種化合物對(duì)糞腸球菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，鹽酸白屈菜紅堿和雷公藤紅素的MIC 分別為10.4 μmol/L（4 μg/ml）和4.4 μmol/L（2 μg/ml）；其次，鹽酸白屈菜紅堿對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較強(qiáng)抑制作用，MIC 為41.6 μmol/L（16 μg/ml）。而鹽酸小檗堿為臨床廣泛應(yīng)用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾的中藥單體藥物，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)這4 株菌無(wú)明顯抑制作用。

表3 鹽酸白屈菜紅堿和雷公藤紅素對(duì)4 株臨床質(zhì)控菌株的MIC（μg/ml）

3 討論

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，臨床廣泛應(yīng)用的來(lái)源于中藥的抗菌有效成分，鹽酸小檗堿對(duì)海洋弧菌是沒(méi)有抑制作用的，而白屈菜紅堿和雷公藤紅素卻有抑制作用。雷公藤紅素（tripterine，又稱(chēng)南蛇藤素celastrol）是從植物雷公藤的根部分離到的一種三萜類(lèi)色素，具有抗氧化、抗腫瘤新生血管生成、抗類(lèi)風(fēng)濕、抗炎等多種藥理作用。既往文獻(xiàn)表明，雷公藤紅素可抑制金黃色葡萄球菌［8］和嗜麥芽窄食單胞菌［9］的生物膜（biofilm）的生成，具有抗菌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對(duì)VV、VP 以及糞腸球菌具有選擇性抑制作用。白屈菜紅堿（chelerythrine）是一種異喹啉類(lèi)的苯并菲啶型生物堿，廣泛存在于紫堇科、罌粟科、毛茛科和蕓香科植物中，具有廣泛的藥理活性。以往的研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿對(duì)于白色念珠菌、近平滑念珠菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑念珠菌有一定的抗真菌活性，對(duì)植物致病真菌也具有較好的抑制作用，還有抗腫瘤作用、殺蟲(chóng)活性以及抗纖維化作用等［10］。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿對(duì)于VV、VP以及糞腸球菌具有很強(qiáng)的抑制作用。中草藥的開(kāi)發(fā)利用，最有科學(xué)性和應(yīng)用價(jià)值的地方就在于從中分離鑒定到具有活性的單體成分并搞清楚其作用機(jī)制，因此雷公藤紅素和白屈菜紅堿對(duì)于海洋弧菌的抗菌作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。以上2 種抗菌有效成分，為海洋弧菌感染治療提供了新的選擇，也進(jìn)一步拓寬了中草藥在治療海洋弧菌及糞腸球菌感染的應(yīng)用空間。