楊 鼎 呂鳳仙 李崇娟 徐學忠 胡靖鋒 楊紅麗 蘭梅 張麗琴 董相書 和江明*

（1 云南大學，云南昆明 650504；2 云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所，云南昆明 650205；3 國家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

根腫病是一種世界性病害，主要危害十字花科作物，在我國北到黑龍江，南到廣東、廣西都有分布，而四川、山東、湖北、云南、重慶等地是我國根腫病發(fā)生重災區(qū)（孫朝輝 等，2016）。結球甘藍（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.）簡稱甘藍，為兩年生十字花科蕓薹屬蔬菜作物，是我國重要的蔬菜作物之一，年種植面積約90 萬hm2（楊麗梅等，2021）。近年來，甘藍根腫病發(fā)生面積急劇增加，導致其品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度下降，甚至絕收（孫超 等，2016），急需育成抗病品種來解決困境。目前，結球甘藍抗病品種均為國外Ogura CMS 品種，轉育十分困難，不利于優(yōu)異種質(zhì)獲得、利用。因此，創(chuàng)制具有Ogura CMS 恢復基因的抗根腫病甘藍材料對于甘藍抗病聚合育種具有重大意義。前人通過對甘藍及其變種的抗性發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)抱子甘藍和歐洲的各種野生甘藍抗性較強，但均存在抗性遺傳不穩(wěn)定、不易轉育的問題（Crisp et al.，1989；陳欣 等，2015）。國外通過種間雜交等手段，將蘿卜中的抗性基因轉移到甘藍中，獲得了一些抗病品種，如美國的先甘809、日本龍井275 等；但是國內(nèi)可以利用的甘藍根腫病抗源材料較少，并且存在抗性單一的問題，例如CR49、CR52 等（司軍 等，2008）。

自Ogura CMS不育胞質(zhì)轉育到蕓薹屬作物中，國內(nèi)外育種家通過體細胞融合、遠緣雜交等方法將外源Rfo、Rfk1（Rfo基因的同源基因）育性恢復基因轉移到甘藍型油菜和白菜型油菜中，使其育性得到恢復（Delourme et al.，1998；Niemel? et al.，2010）。中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍育種團隊利用含有Rfo育性恢復基因的甘藍型油菜與Ogura CMS 芥藍遠緣雜交，將甘藍型油菜中的Rfo育性恢復基因導入到橋梁材料芥藍中，再與芥藍進行多代回交、標記篩選、育性和細胞學觀察，獲得了結實性正常、育性恢復穩(wěn)定、形態(tài)與芥藍一致，染色體數(shù)為18 條（2n=18）的芥藍Ogura CMS 育性恢復材料（Yu et al.，2016，2017）；隨后將所獲得的芥藍恢復材料與Ogura CMS 抗根腫病甘藍材料進行雜交，獲得了含有CRb抗性基因的甘藍材料（于海龍，2018），通過該材料進行育性恢復-胞質(zhì)替換兩步法和多代回交、自交，最終獲得了CRb基因純合的根腫病抗性甘藍材料（Ren et al.，2020），成功以芥藍為橋梁獲得育性恢復的抗根腫病甘藍材料。

本試驗以對根腫菌4 號生理小種有良好抗性的先甘336 作為母本，與甘藍型油菜Ogura CMS 恢復材料N21015 進行種間雜交，通過甘藍和甘藍型油菜雜交復合種的獲得，以期將良好的根腫病抗性基因和恢復基因轉移到雜種中，獲得對根腫菌4 號生理小種具有抗性且攜帶恢復基因的種間材料，為從源頭上解決抗根腫病甘藍育種的難題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘藍品種先甘366 對根腫菌4 號生理小種具有良好抗性，購自先正達公司；經(jīng)室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定和分子標記鑒定確定不含根腫病抗性基因的甘藍材料GL21028，甘藍型油菜Ogura CMS 恢復材料N21015 和不含恢復基因的N160R均由云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所十字花科課題組提供。

供試菌種采集于云南省昆明市嵩明縣根腫病多發(fā)地區(qū)的甘藍腫根，經(jīng)Williams 鑒定系統(tǒng)鑒定為4號生理小種，甘藍腫根清洗后保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 2021 年種植在云南省農(nóng)業(yè)科學院嵩明科研基地設施大棚內(nèi)，先甘366、GL21028、N160R 于3 月1 日播種，N21015 于4 月20 日播種；選取顆粒飽滿的種子，采用50 孔穴盤和育苗專用基質(zhì)進行育苗，每份材料3 盤。

1.2.2 DNA 提取及含量測定 幼苗長出第1 片真葉時，使用北京全式金生物技術股份有限公司的DNA 試劑盒提取DNA。分別取100 mg 子葉于-20℃冷凍，采用葉片研磨機研碎后參照試劑盒流程提取DNA；然后，使用1× TE 緩沖液溶解稀釋DNA至100 ng·μL-1，1%瓊脂糖凝膠電泳及核酸檢測儀檢測DNA 的質(zhì)量。置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 甘藍根腫病表型鑒定 3 月15 日，先甘366和GL21028 幼苗長出2 片真葉后，控水處理1 d，然后采用注射法分別接種根腫菌4 號生理小種菌液，接種濃度為1 × 108個·mL-1，每穴1 mL；以分別注射1 mL 蒸餾水作為空白對照，每處理1 盤。接種45 d 后，參考司軍等（2009）的分級標準分別統(tǒng)計甘藍植株根腫病發(fā)病情況。

1.2.4 甘藍抗根腫病分子標記篩選 利用孫超等（2016）、何海燕（2018）、劉笑顏（2020）、甘彩霞等（2022）設計的7 對與根腫病相關抗性基因連鎖的分子標記（表1），以不含根腫病抗性基因的GL21028 為對照，參照蘭梅等（2021）的方法對先甘366 進行分子標記鑒定。分別以先甘366、GL21028 的DNA 作為模板，依次采用7 對引物進行PCR 擴增；然后取PCR 產(chǎn)物1 μL，250 V、30 min 條件下使用1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察并拍照，篩選出適合本試驗的抗根腫病分子標記，即在先甘366中具有條帶而在GL21028 中無條帶的引物。

表1 甘藍根腫病抗性基因引物序列

1.2.5 甘藍型油菜Ogura CMS 恢復基因分子標記篩選利用Primard-Brisset 等（2005）、Hu 等（2008）、楊其東等（2016）設計的7 對與Ogura CMS 恢復基因相關的分子標記（表2），以不含恢復基因的N160R 為對照，對N21015 進行分子標記鑒定，方法同1.2.4。篩選出適合本試驗的恢復基因分子標記，即在N21015 中具有條帶而在N160R中無條帶的引物。

表2 甘藍型油菜恢復基因引物序列

1.2.6 種間雜交胚挽救 4 月1 日，將6 片真葉的先甘366 幼苗轉移至人工冷庫，4 ℃條件下春化75 d，然后定植于單獨隔離的大棚內(nèi)，常規(guī)管理；N21015 同時定植。雜交前摘除父、母本開放花朵，套袋隔離，父本開花1～2 d 進行雜交，取母本3 mm 長的花蕾剝蕾授以父本花粉，配制先甘366 × N21015 雜交組合。授粉后套袋隔離，防止其他花粉污染。雜交12 d 后，取莢進行胚挽救。參照姜嬌（2018）的胚挽救培養(yǎng)基研究結果，配制種間雜交胚挽救培養(yǎng)基E（MS+0.5 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC +5 g·L-1CH），挑選綠色、飽滿的胚珠接種到該培養(yǎng)基上，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強度1 500 lx 的條件下進行培養(yǎng)；成功分化的胚珠轉移到培養(yǎng)基D（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）上，繼續(xù)培養(yǎng)；分化至具有完整植株形態(tài)后，轉接到1/2 MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。待植株生根并長出1 對真葉后，將根長3 cm 左右的幼苗定植于蛭石基質(zhì)中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強度2 000 lx、相對濕度65%條件下進行煉苗；成活植株于7 d 后室外常規(guī)管理，15 d 后移栽至大棚內(nèi)，常規(guī)水肥管理。

1.2.7 種間雜種人工誘導染色體加倍 8 月11 日，在移栽成活的種間雜種植株腋芽和生長點處滴0.2%秋水仙素50 μL，每天1 次，連續(xù)處理3 d。待植株抽薹開花后，于盛花期對植株花粉進行觀察，對花粉正常的植株進行花粉育性檢測。于晴天上午11：00—12：00 采集具有正常花粉的花朵，使用亞歷山大染液進行染色觀察，每朵花統(tǒng)計400 個花粉粒，計算花粉可育率，判斷植株是否恢復育性。

1.2.8 種間雜種鑒定 ①形態(tài)學觀察：成活后的雜種植株，在生長茂盛時期觀察葉形、葉色、葉面特征、花器官的顏色大小等性狀，并分別與兩個親本進行比較，判斷雜種真實性。

② 染色體分析：以父、母本及F1雜種植株為試材，參考Yang 等（2017）的方法進行雌蕊染色體觀察，統(tǒng)計雜種雌蕊染色體數(shù)目，對經(jīng)染色體誘導加倍成功和未加倍處理的F1雜種植株進行對比分析，并與父、母本進行比較，判斷雜種倍性及其真實性。

③分子標記鑒定：以F1雜種幼嫩葉片為試材，提取DNA，方法同1.2.2。利用1.2.4、1.2.5 篩選出來的引物進行PCR 擴增，使用1.8%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測，觀察條帶位置，分別與母本抗根腫病基因條帶和父本恢復基因條帶進行對比，判斷雜種是否攜帶根腫病抗性基因和Ogura CMS 恢復基因。

④ 抗根腫病表型鑒定：以F1雜種植株為試材，接種根腫菌，方法同1.2.3，統(tǒng)計雜種植株根腫病發(fā)病情況，結合分子標記鑒定結果，判斷雜種是否獲得抗性遺傳。

2 結果與分析

2.1 DNA 檢測結果

試驗結果表明，先甘366、GL21028、N21015、N160R 提取的DNA 均表現(xiàn)為條帶清晰、整齊，無拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA 質(zhì)量較好。核酸檢測儀檢測顯示，4 份材料單株DNA 樣品濃度在800～2 000 ng·μL-1之間，A260/A280在1.9～2.0之間，證明DNA 質(zhì)量可以滿足后續(xù)分子標記鑒定要求。

2.2 甘藍根腫病表型鑒定結果

對先甘366 和GL21028 進行室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定，結果如圖1 所示。不含根腫病抗性基因的GL21028 接種處理完全發(fā)病，發(fā)病級別最高達7 級；而先甘366 接種處理以及2 份材料的空白對照均未出現(xiàn)發(fā)病植株，說明先甘366抗根腫病。

圖1 甘藍根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定結果

2.3 甘藍抗根腫病分子標記篩選結果

利用7 對已知與根腫病相關抗性基因連鎖的分子標記引物對先甘366 和GL21028 進行鑒定，凝膠電泳結果如圖2 所示。Crg-1 和Crg-2 在先甘366 中具有清晰條帶，而在GL21028 中沒有條帶或條帶不清；Crg-3、Crg-4、Crg-6 在先甘366 和GL21028中都沒有條帶；Crg-5 在GL21028 中有清晰條帶，但在先甘366 中條帶不清；Crg-7 在先甘366 和GL21028 中都有清晰條帶。綜上，Crg-1 和Crg-2 兩對引物可以鑒定出先甘366 攜帶抗性基因，適用于本試驗，可以用作后續(xù)子代的抗性遺傳鑒定。

圖2 甘藍抗根腫病分子標記篩選結果

2.4 甘藍型油菜Ogura CMS 恢復基因分子標記篩選結果

利用7 對與Ogura CMS 恢復基因相關的分子標記引物對N21015 和N160R 進行鑒定，凝膠電泳結果如圖3 所示。Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6 在含有恢復基因的N21015 中具有清晰條帶，在不含恢復基因的N160R 中沒有條帶；Rfo-2、Rfo-7 在N21015和N160R 中均沒有清晰條帶；Rfo-3、Rfo-5 在N21015 和N160R 中均出現(xiàn)清晰條帶。綜上，引物Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 可以鑒定出N21015 攜帶恢復基因，適用于本試驗，可以用作后續(xù)子代的恢復基因鑒定。

圖3 甘藍型油菜Ogura CMS 恢復基因分子標記篩選結果

2.5 種間雜交胚挽救結果

先甘366 × N21015 種間雜交后，在母本植株上自然結實率為0，而雜種胚珠在培養(yǎng)基E 上成功萌發(fā)（圖4-A），獲得了種間雜種植株，證明甘藍×甘藍型油菜種間雜交后代不結實，需要通過人工胚挽救培養(yǎng)，才可以獲得雜種后代。

圖4 先甘366 × N21015 胚挽救過程

將增殖分化的胚珠轉移到培養(yǎng)基D 上，愈傷組織在該培養(yǎng)上增殖效果較好（圖4-B），表明該培養(yǎng)基適合用作先甘366 × N21015 雜種后代的增殖培養(yǎng)。將增殖后具有完整植株形態(tài)的幼苗轉接到1/2 MS 培養(yǎng)基上能夠很好地生長，并形成良好的根系（圖4-C），表明1/2 MS 培養(yǎng)基適合雜種后代的生根培養(yǎng)。煉苗過程中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強度2 000 lx、相對濕度65%條件下幼苗生長良好，移栽到田間后全部成活。

2.6 種間雜種染色體誘導加倍及育性鑒定結果

使用0.2%秋水仙素對移栽成活的幼苗連續(xù)處理3 次，成功獲得染色體加倍的F1雜種。由圖5-A、B 可見，染色體加倍成功的雜種植株莖葉比未加倍雜種植株肥大?；ǚ壅５幕ǘ浠ǚ塾詸z測結果表明，雜種植株花粉可育率為78.46%（圖5-C、D），育性正常，染色體誘導加倍成功，成功獲得可育的異源六倍體種間雜種。

圖5 種間雜交F1 染色體誘導加倍及花粉育性情況

2.7 種間雜種鑒定結果

2.7.1 形態(tài)學表現(xiàn) 由圖6 可見，先甘366 ×N21015 種間雜種植株各性狀皆介于親本之間，葉片形狀為卵圓形，葉色墨綠，有少量蠟粉，與母本更為接近；葉柄著生3 對小葉，葉片生長松散，植株形態(tài)與父本更為接近；花朵顏色為黃色，花瓣“十”字形，形狀近似圓形，更接近父本，花朵大小介于父、母本之間。綜上，可初步判斷所得雜種植株為先甘366 × N21015 種間雜交所得真雜種。

圖6 先甘366 × N21015 種間雜交植株及花器官形態(tài)

2.7.2 染色體分析 由圖7 可知，未加倍的種間雜交F1雌蕊染色體數(shù)目為28 條，加倍后的F1雌蕊染色體數(shù)目為56 條，是未加倍的2 倍，且為母本先甘366（2n=18）與父本N21015（2n=38）染色體數(shù)目之和。表明，雜種植株均為真雜種，且染色體誘導加倍成功，成功獲得異源六倍體種間雜種。

圖7 種間雜交F1 未加倍和加倍雌蕊染色體情況

2.7.3 分子標記鑒定結果 對種間雜種進行根腫病抗性基因分子標記鑒定，結果如圖8 所示。利用Crg-1 和Crg-2 兩對引物進行PCR 擴增，雜種條帶清晰，且均與母本先甘366 的條帶位置一致，表明雜種攜帶母本的根腫病抗性基因。

圖8 種間雜交F1 抗根腫病分子標記鑒定結果

對種間雜種進行Ogura CMS 恢復基因分子標記鑒定，結果如圖9 所示。利用Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 等3 對引物進行PCR 擴增，雜種均有與父本N21015 位置相同的條帶，表明雜種攜帶父本含有的Ogura CMS恢復基因。

綜上所述，先甘366 × N21015 種間雜交F1同時具有母本的根腫病抗性基因和父本的Ogura CMS恢復基因，所得雜種為真雜種。

2.7.4 抗根腫病表型鑒定結果 由圖10 可知，種間雜種接種處理、空白對照以及GL21028 空白對照均未出現(xiàn)發(fā)病植株，而GL21028 接種處理植株全部發(fā)病。參照司軍等（2009）的標準，雜種對根腫病表現(xiàn)為免疫，表明所得到的種間雜種具有母本的根腫病抗性基因，與分子標記鑒定結果一致。

圖10 種間雜交F1 根腫病發(fā)病情況

3 討論與結論

傳統(tǒng)抗病育種采用單一表型鑒定的方法，易受環(huán)境影響，且費時費力，而通過表型鑒定結合分子標記不但能夠快速進行篩選，還能準確鑒別出所期望性狀。司軍等（2011）、袁天成（2014）、梁峰豪等（2019）、李倩等（2021）通過室內(nèi)苗期人工接種和分子標記輔助鑒定，篩選出對根腫病具有抗性的甘藍和甘藍型油菜材料，并構建了相關的分級標準。本試驗采用室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定方法，參考司軍等（2009）的病害分級標準，成功對母本抗根腫病甘藍品種先甘366 和不抗根腫病甘藍材料GL21028 在表型上進行了區(qū)分，確定先甘366對根腫病具有抗性。同時，使用何海燕（2018）設計的甘藍根腫病連鎖SCAR 分子標記Crg-1、Crg-2，甘彩霞等（2022）設計的針對RsCr2的SSR 分子標記Crg-7，孫超等（2016）設計的針對抗根腫病同源基因CRa、Crr1a的分子標記Crg-3、Crg-4，劉笑顏（2020）設計的針對根腫病抗性基因CRd、CRb的分子標記Crg-5、Crg-6，篩選出對本試驗適用的2 對引物Crg-1 和Crg-2。對先甘366 × N21015 種間雜交F1進行抗根腫病表型鑒定和分子標記鑒定，結果表明獲得的種間雜種對根腫病表現(xiàn)為免疫，攜帶母本的根腫病抗性基因。

我國甘藍抗根腫病品種很少，且適應范圍很窄，因此國內(nèi)對于根腫病的防治主要集中在物理和化學方法上，但防治效果均不理想，所以選育抗病品種是防治根腫病最根本的辦法。沈舒（2019）、曾愛松等（2021）通過遠緣雜交將白菜的根腫病抗性基因導入到甘藍中，獲得了抗根腫病的甘藍材料，種間雜種的遺傳背景與甘藍相似度較高于海龍（2018）以Ogura CMS 芥藍為母本，以攜帶恢復基因的甘藍型油菜為父本，結合Ogura CMS 恢復基因分子標記進行背景篩選，成功將相關恢復基因導入到母本中，獲得具有育性恢復的種間雜種，通過不斷回交獲得染色體為19 條且含有恢復基因的芥藍材料；姜嬌（2018）通過將于海龍（2018）獲得的含恢復基因的芥藍材料與抗根腫病的Ogura CMS 甘藍進行雜交，獲得了含有根腫病抗性的種間雜種材料。石汶汶（2019）以Ogura CMS 甘藍為母本，以攜帶恢復基因的甘藍型油菜為父本，通過胚挽救成功創(chuàng)制出甘藍Ogura CMS BC1四倍體雜種育性恢復材料。本試驗利用Primard-Brisset等（2005）、Hu 等（2008）和楊其東等（2016）設計的針對Rfo恢復基因分子標記的7 對引物，對N21015 和N160R 進行初步篩選，篩選出了對本試驗適用的3 對引物Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6。對先甘366 × N21015 種間雜交F1進行分子標記鑒定，結果表明成功獲得了含有Ogura CMS 恢復基因的種間雜種。

胚挽救可以解決遠緣雜交不結實的問題，姜嬌（2018）、石汶汶（2019）通過胚挽救成功獲得了甘藍和甘藍型油菜的種間雜種。本試驗亦利用胚挽救對甘藍×甘藍型油菜種間雜種進行培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基E（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg ·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC+5 g·L-1CH）能夠為雜種胚珠提供很好的生長條件，獲得生長良好的愈傷組織；而增殖培養(yǎng)基D（MS +0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）對愈傷組織具有良好的誘導效果，能夠形成多個生長點。表明增殖培養(yǎng)基添加水解酪蛋白（CH）和活性炭（AC）對種間雜種胚挽救增殖組織生長有利，可以成功得到種間雜種，這與姜嬌（2018）的研究結果一致，但是在培養(yǎng)基植物激素添加的量上有所差別，可能是因為不同基因型所得到的種間雜種對不同植物激素的需求量有所不同。對增殖培養(yǎng)后具有植株形態(tài)的綠植體，使用1/2 MS 培養(yǎng)基對成苗和生根都具有良好的效果，這與呂鳳仙等（2021）生根培養(yǎng)基需要添加植物激素有所不同，表明不同雜種生根所需條件不一樣。因此，實際應用中應該考慮不同品種的植物學特性，適當選擇各種植物激素的配比濃度。

本試驗得到的種間雜種為異源三倍體，減數(shù)分裂染色體無法正常聯(lián)會配對，從而不具有育性。人工誘導染色體加倍后植株恢復育性，花粉活力較好，植株形態(tài)偏向于甘藍型油菜，這與于海龍（2018）的研究結果相同，可能是因為甘藍型油菜的遺傳背景在雜種中占比較大。本試驗通過遠緣種間雜交和胚挽救，在表型鑒定結合分子標記的基礎上，快速對親本和雜種進行背景篩選和鑒定，成功獲得了同時攜帶根腫病抗性基因和Ogura CMS 恢復基因的甘藍×甘藍型油菜雜種F1，為后續(xù)甘藍抗性育種和恢復材料的創(chuàng)制奠定了基礎。