陳一鳴，李桓，武上雯，龔曉紅，陸超群，李松偉

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.泗陽康達(dá)醫(yī)院，江蘇 泗陽 223700； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE) 是一種自身免疫功能受限介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，能在不同的血管及組織中引起免疫復(fù)合物沉淀，最終導(dǎo)致器官病變[1]。腎臟受累在SLE患者中很常見，狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE總體發(fā)病率和病死率高的主要危險(xiǎn)因素[2]。目前，臨床針對(duì)LN的治療和預(yù)后方面取得的效果有限，腎衰竭的比例仍然居高不下[3]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，可作為治療LN的一種重要手段，但具體分子機(jī)制尚不明確。

古代醫(yī)學(xué)中未有LN病名的明確記載，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)將LN歸屬為“紅蝴蝶瘡”“腎臟風(fēng)毒”“陰陽毒”“水腫”等范疇[4]。本病多屬素體稟賦不足，陰陽失調(diào)，腎陰本虧[5]。六味地黃丸是臨床治療腎陰虧虛的代表方劑。有研究表明，其可顯著提高環(huán)磷酰胺和糖皮質(zhì)激素對(duì)LN的治療效果，并能有效減輕使用糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺的不良反應(yīng)[6]。激素類藥物聯(lián)合六味地黃丸可通過降低其晚期糖基化終產(chǎn)物(receptor of advanced glycation end products，RAGE)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)及分形趨化因子(fractalkine，F(xiàn)KN)的表達(dá)水平，提高LN的治療效果[7]。另有研究表明，其還能夠有效降低SLE患者血清白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)及單核細(xì)胞趨化蛋白-4(monocyte chemotactic protein 4，MCP-4)水平、恢復(fù)輔助性T細(xì)胞1(Th1)和輔助性T細(xì)胞2(Th2)免疫平衡[8]。目前，六味地黃丸治療LN的臨床研究已得到多方驗(yàn)證，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，旨在探究六味地黃丸治療LN的藥物有效成分及其潛在的治療作用機(jī)制，為后續(xù)LN的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 有效成分的收集與篩選及其相關(guān)靶點(diǎn)的獲取使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)檢索六味地黃丸中熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉和茯苓的化學(xué)成分。根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選出六味地黃丸的有效成分的作用靶點(diǎn)。通過Uniport數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化處理獲得與作用靶點(diǎn)匹配的基因。

1.2 LN疾病靶點(diǎn)獲取以“l(fā)upus nephritis”為關(guān)鍵詞，使用OMIM(http：//www.omim.org/)、GeneCards(http：//www.genecareds.org/)、DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)等數(shù)據(jù)庫，獲取與LN相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 獲取六味地黃丸治療LN相關(guān)的潛在靶點(diǎn)利用在線平臺(tái)Venny 2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/)將上述1.1與1.2獲得的靶點(diǎn)繪制韋恩圖，交集基因即為六味地黃丸治療LN相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建潛在靶點(diǎn)的蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)收集1.3獲得的潛在靶點(diǎn)上傳STRING數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)，種屬設(shè)置為“Homosapiens”，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape(3.8.2)進(jìn)一步繪制，節(jié)點(diǎn)即有效成分與疾病潛在的靶點(diǎn)，邊即節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系，構(gòu)建六味地黃丸治療LN的潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.5 富集分析使用R語言的“BiocManager”，“org.HS.eg.db”，“clusterProfiler”等程序包，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，以確定靶基因的分子功能和作用機(jī)制，并通過氣泡圖將結(jié)果可視化。

1.6 分子對(duì)接篩選得到六味地黃丸中相應(yīng)的藥物活性成分，通過PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其對(duì)應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)；PDB(http：//www.rcsb.org/)獲得核心靶點(diǎn)3D結(jié)構(gòu)。使用AutoDock、Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，利用PyMOL 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸有效成分收集、篩選及相關(guān)靶點(diǎn)獲取通過數(shù)據(jù)庫分析獲得六味地黃丸組方中的化學(xué)有效成分共計(jì)69個(gè)(熟地黃2個(gè)，山茱萸20個(gè)，山藥16個(gè)，牡丹皮11個(gè)，茯苓15個(gè)，澤瀉10個(gè))。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，共獲得六味地黃丸有效成分靶點(diǎn)基因210個(gè)。將中藥、化合物成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，構(gòu)建六味地黃丸組方的化學(xué)有效成分及預(yù)測靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

圖1 中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 疾病作用靶點(diǎn)獲取結(jié)果通過1.2中的數(shù)據(jù)庫檢索獲取LN的相關(guān)靶點(diǎn)1 357個(gè)與六味地黃丸的210個(gè)靶點(diǎn)繪制LN疾病靶點(diǎn)與藥物有效成分靶點(diǎn)韋恩圖，見圖2。

圖2 藥物預(yù)測靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將2.2獲得的103個(gè)交集基因，上傳String在線數(shù)據(jù)庫，通過Cytoscape3.8.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。共有103個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 879條邊，獲得度中心性(degrree centrality，DC)前10位的核心基因：蛋白激酶B1 (AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、IL-6、腫瘤抗原p53(TP53)、IL-1β、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、半胱天冬酶3(CASP3)、前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase 2，PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP9)、CXC趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)，見表1。

圖3 六味地黃丸治療LN的PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 六味地黃丸治療LN的關(guān)鍵靶點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)度值排序前10位)

2.4 GO功能、KEGG信號(hào)通路富集分析采用GO功能、KEGG信號(hào)通路富集技術(shù)，對(duì)獲得的103個(gè)參與六味地黃丸治療LN潛在靶點(diǎn)的基因進(jìn)行宏觀生物學(xué)評(píng)價(jià)。共有4 481個(gè)GO功能，包括與對(duì)脂多糖、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)以及活性氧代謝過程等3 812個(gè)生物學(xué)過程(biological process，BP)相關(guān)；與膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)等245個(gè)細(xì)胞成分(cellular component，CC)密切相關(guān)；與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等424個(gè)分子功能(molecular function，MF)有關(guān)，見圖4。

圖4 六味地黃丸治療LN關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集分析

2.5 六味地黃丸治療LN關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路分析KEGG分析結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路242條，主要包括IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路等，見圖5。

圖5 六味地黃丸治療LN的KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖

其中，在前30位通路中，AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β涉及15個(gè)以上的通路(圖6)，且在PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因中均位列前10位，這表明AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β可能為六味地黃丸治療LN的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6 六味地黃丸治療LN的KEGG弦圖

2.6 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接采用分子對(duì)接技術(shù)分析六味地黃丸中主要活性成分與AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β蛋白的相互作用。從PBD數(shù)據(jù)庫中獲得靶點(diǎn)蛋白相對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)。分別下載其PDB Formant 格式文件，運(yùn)用AutoDock、Vina軟件進(jìn)行分子化合物依次虛擬對(duì)接，結(jié)果見表2。若結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1，則表示具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。選取山柰酚(MOL000322)與AKT1(PDBID：3mv5)，槲皮素(MOL000098)與JUN(PDBID：5t01)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與 IL-6(PDBID：4zs7)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與 IL-1β(PDBID：3ltq)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與TP53(PDBID：5o1h)，借助Pymol2.5.0軟件分別進(jìn)行分子對(duì)接可視化分析，見圖7。

表2 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

圖7 分子對(duì)接模式圖

3 討論

《類經(jīng)》曰：“然正本拒邪，正氣不足，邪反隨之而入，故曰相引”“蓋邪氣多有余，正氣多不足?！蹦I虛是LN發(fā)病的內(nèi)在因素，而長期使用激素以及細(xì)胞毒類藥物，極易產(chǎn)生熱毒，內(nèi)邪、外邪雜至，灼傷營陰，加重病情發(fā)展[9]。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)揭示六味地黃丸治療LN的協(xié)同作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸中的多種藥物活性成分可以通過多個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)揮治療LN的作用。研究表明，六味地黃丸治療LN的活性成分包括槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷元、谷甾醇、β-谷固醇、豆甾醇等。

槲皮素是一種分布廣泛且具有多種藥理學(xué)作用的黃酮類化合物[10]。研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗纖維化等多種生物學(xué)功能[11]。周小剛等[12]證明，槲皮素可能通過調(diào)節(jié)自身免疫，減少炎癥因子生成，抑制補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活從而對(duì)紅斑狼瘡小鼠模型有明顯的保護(hù)作用。

山柰酚也是一種廣泛存在于多種水果、蔬菜以及中草藥等天然植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抑制蛋白激酶等多方面的藥用價(jià)值[13]。山柰酚可以增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的抑制功能，通過老鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其可提高Tregs的叉頭盒P3(transcription factor forkhead box P3，F(xiàn)OXP3)表達(dá)水平，并防止由膠原蛋白引起關(guān)節(jié)炎的組織病理改變，同時(shí)能減少PIM1介導(dǎo)的FOXP3磷酸化S422，尤其是對(duì)一系列炎癥性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強(qiáng)直性脊柱炎等)的預(yù)防和治療提供參考[14]。

薯蕷皂苷元是一種廣泛分布于葫蘆巴屬及薯蕷屬植物中天然甾體皂苷元，常被用作合成甾體藥物的前體[15]。薯蕷皂苷元在降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎和抗增殖活性等方面發(fā)揮重要作用[16]。薯蕷皂苷元可以通過抗氧化、免疫等方面改善慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠腎毒性，血清肌酐、尿素氮、白蛋白和總蛋白水平升高，尿電解質(zhì)水平升高，促炎細(xì)胞因子、抗氧化參數(shù)顯著下降，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性腎臟保護(hù)作用[17]。

GO功能富集分析顯示，多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程涉及AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β等核心靶點(diǎn)。其中，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又叫作蛋白激酶B，是磷脂酰激醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K)/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上控制細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期的主要下游靶蛋白，同時(shí)磷酸化的AKT還可調(diào)控下游因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18]。并且可以通過激活A(yù)KT/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，與SLE的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[19]。IL-6是重要的免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥因子，可以刺激B細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)證明，IL-6表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病密切相關(guān)[20]。TP53基因擁有廣泛的生物學(xué)功能，生物信息學(xué)分析表明，miR-564在SLE患者中得到了調(diào)節(jié)，而TP53是miR-564的核心靶基因[21]。IL-1β是一種多效性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，它被證明是一種有效的促炎藥物，在炎癥反應(yīng)中也是有重要作用的細(xì)胞因子[22]。其也被證明與SLE的易感性和活動(dòng)度密切相關(guān)[23]。

KEGG信號(hào)通路富集分析顯示，六味地黃丸可通過IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和HIF-1信號(hào)通路等發(fā)揮生物學(xué)作用，以影響LN疾病進(jìn)程。既往研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡模型小鼠的 miR-23b能夠通過抑制IL-17/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活來保護(hù)機(jī)體，而IL-17能降低細(xì)胞中miR-23b的表達(dá)，激活I(lǐng)L-17信號(hào)通路，從而促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)展[24]。TNF是一種介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)因子，在狼瘡患者血清中水平較高[25]。狼瘡患者的TNF-α信號(hào)通路被激活，并通過NF-κB激活炎癥信號(hào)通路，造成局部炎癥暴發(fā)、組織損傷壞死和自身抗原暴露，加速疾病的發(fā)生和發(fā)展[26]。Th17細(xì)胞分化水平與SLE活動(dòng)度密切相關(guān)[27]。潘海峰[28]發(fā)現(xiàn)，SLE患者Th17通路相關(guān)因子血清水平及mRNA水平表達(dá)均有異常，表明Th17通路調(diào)節(jié)異常與SLE的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。HIF-1能調(diào)控與代謝相關(guān)基因或酶的表達(dá)，具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化的作用[29]。通過上調(diào)HIF-1水平，狼瘡小鼠模型腎小球系膜細(xì)胞增殖明顯，系膜細(xì)胞凋亡減少，說明HIF-1能促進(jìn)細(xì)胞的增殖從而加重狼瘡的病理變化[30]。

綜上所述，六味地黃丸可能通過槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷元等多種化學(xué)活性成分，對(duì)LN起防治作用。