朱永紅，吳慎杰，李 靜，張換樣，焦改麗，竹夢(mèng)婕，秦麗霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；2.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000）

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)人口多耕地少，糧棉爭(zhēng)地的矛盾一直比較突出。提高棉花品種的耐鹽性，發(fā)展鹽堿地植棉，拓寬植棉面積對(duì)于我國(guó)棉花生產(chǎn)以及糧食生產(chǎn)具有重要意義[1]。從“七五”開(kāi)始，我國(guó)開(kāi)始開(kāi)展棉花耐鹽堿育種工作，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位已經(jīng)育成了山農(nóng)N0、2F502-2、商丘40一些耐鹽性較好的品種[2]。然而，常規(guī)耐鹽育種選育的棉花品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，選育周期長(zhǎng)，且常規(guī)品種耐鹽能力很有限。而且傳統(tǒng)的遺傳育種方法并不能很有效地提高植株耐鹽脅迫應(yīng)答能力[3-4]。因此，利用基因工程技術(shù)培育棉花抗逆（高鹽、干旱、低溫等）新品種已經(jīng)成為棉花育種領(lǐng)域的新趨勢(shì)。

利用基因工程技術(shù)研發(fā)耐鹽棉花品種，已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。例如，嗜鹽孢子菌H+-PPase基因TsVP在高鹽條件下可改善棉花根和莖的生長(zhǎng)和光合活性。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植物的膜離子泄漏和丙二醛水平降低，轉(zhuǎn)基因植物有助于Na+和Cl?在液泡的隔離。TsVP的表達(dá)也提高了棉花的發(fā)芽率和存活率，在高鹽環(huán)境下改善纖維質(zhì)量。另一項(xiàng)研究表明，擬南芥液泡焦磷酸酶編碼AVP1的表達(dá)改善了轉(zhuǎn)基因棉花在鹽脅迫下的生長(zhǎng)和纖維產(chǎn)量[5]。ST6-40基因是采用功能基因挖掘的方法分離得到的。在鹽脅迫下，基于小鹽芥cDNA文庫(kù)的表達(dá)，構(gòu)建源種質(zhì)cDNA表達(dá)文庫(kù)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，建立了超過(guò)125 000個(gè)獨(dú)立株系組成的轉(zhuǎn)基因種子文庫(kù)，通過(guò)高通量遺傳篩選法篩選耐鹽株系，分離出多種耐鹽株系，通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定小鹽芥CDNA，分離得到了ST6-40基因。這種功能基因挖掘方法強(qiáng)調(diào)了表達(dá)基因的功能，因此克隆的基因與耐鹽功能直接相關(guān)。在擬南芥過(guò)量表達(dá)ST6-40基因，植物根系長(zhǎng)度、葉片及株高都有顯著提高[6-7]，但有關(guān)其耐鹽機(jī)理目前尚不清楚。

本研究擬將ST6-40基因轉(zhuǎn)入棉花品種R15中，通過(guò)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行多代的PCR鑒定和耐鹽鑒定，以獲得ST6-40基因能穩(wěn)定遺傳且耐鹽性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因棉花品系，旨在為培育抗逆性棉花新種質(zhì)提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

R15，為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所利用陸地棉品種晉棉7號(hào)經(jīng)過(guò)多代再生選育出的胚胎發(fā)生純合系；陸地棉耐鹽對(duì)照品種中99807，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供；pCB2004-ST6-40重組載體（圖1），由中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并提供；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化R15受體，并通過(guò)PCR檢測(cè)[8]獲得ST6-40轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花株系ST6-40-1～ST6-40-65。

圖1 重組載體pCB2004-ST6-40示意Fig.1 Schematic representation of the recombinant vector pCB2004-ST6-40

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因ST6-40的核苷酸序列和蛋白序列分析利用生物信息學(xué)對(duì)目的基因ST6-40（NCBI序列號(hào)：ACF23021.1）的核苷酸序列和蛋白序列進(jìn)行分析。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化法以R15為受體，以下胚軸為外植體，參考陳志賢等[9]的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因棉花。T0按單株種植，并進(jìn)行PCR檢測(cè)[8]，檢測(cè)結(jié) 果為陽(yáng)性 的單株，后 代經(jīng)T1、T2、T3連續(xù)3代按株行種植，先后進(jìn)行葉片噴草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全為陽(yáng)性的植株確定為ST6-40轉(zhuǎn)基因棉花純合株系。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因棉花的PCR鑒定及純合系篩選在超凈臺(tái)上取再生小植株2～3片嫩葉，CTAB法提取R15材料和轉(zhuǎn)基因棉花的基因組DNA，并稀釋至100 ng/μL。通過(guò)PCR和產(chǎn)物測(cè)序鑒定其純合性，反應(yīng)體系為25μL，包 括2.5μL 1×PCR buffer，1.5μL 1.5 mmol/L MgCl2，2.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.5μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.5μL P2引物（0.2μmol/L），2.0μL Template DNA，0.5μLTaqDNA聚合酶，15.5μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；循環(huán)擴(kuò)增階段：95℃40 s→58℃30 s→72℃60 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸保溫7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4ST6-40轉(zhuǎn)基因棉花RNA水平上的鑒定取0.05～0.10 g的幼嫩葉片，分別按照RNA抽提試劑盒（TransZol Plant ET121，Trans）和cDNA一鏈合成試劑盒（Cat#PR037A，TaKaRa）說(shuō) 明 提 取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green Su‐permix（大連寶生物公司）進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL：包括1.0μL 1×PCR buffer，1.0μL 1.5 mmol/L MgCl2，1.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.2μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.2μL P2引物（0.2μmol/L），1.0μL Template DNA，0.2μLTaqDNA聚合酶，5.4μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 °C 20 s；94 °C 3 s，60 °C 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 轉(zhuǎn)基因棉花耐鹽性鑒定T1、T2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株采用盆栽種植，在花鈴期用300 mmol/L NaCl澆灌脅迫7 d后采用酸性茚三酮法[10]測(cè)定葉片游離脯氨酸含量，以判斷棉花耐鹽性差異，游離脯氨酸含量高的品系判定為耐鹽性較好。

1.2.6 T3轉(zhuǎn)基因棉花耐鹽性鑒定將T3陽(yáng)性純合株系轉(zhuǎn)基因棉花及受體對(duì)照種子播種于育苗盤(pán)中，每個(gè)待測(cè)材料進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種50株，試驗(yàn)管理按照轉(zhuǎn)基因生物安全要求進(jìn)行。80%苗長(zhǎng)至2葉時(shí)，將育苗盤(pán)放入底部隔水的鹽池，在鹽池底部澆入1.5%的鹽水，鹽水以剛沒(méi)過(guò)育苗盤(pán)為準(zhǔn)。施鹽后7 d調(diào)查棉苗受害情況，每個(gè)待測(cè)材料調(diào)查3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)調(diào)查20株。根據(jù)棉花鹽害分級(jí)方法和鹽害指數(shù)計(jì)算方法，計(jì)算待測(cè)棉花材料的鹽害指數(shù)。利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。鹽害分級(jí)癥狀描述如下：0級(jí)，棉苗無(wú)黃葉；1級(jí)，有1片子葉發(fā)黃；2級(jí)，2片子葉均發(fā)黃；3級(jí)，有1片子葉受害脫落；4級(jí)，有2片子葉受害脫落。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因ST6-40生物信息學(xué)相關(guān)分析

目的基因ST6-40（（NCBI序列號(hào)：ACF23021.1）cDNA全長(zhǎng)為510 bp，編 碼169個(gè) 氨 基 酸，分 子 質(zhì)量為18 124.08 u，理論等電點(diǎn)為8.66，分子式為C813H1325N209O244S6。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，其序列與NCBI數(shù)據(jù)一致，沒(méi)有基因突變。

2.2 T0的ST6-40轉(zhuǎn)基因棉花PCR鑒定

對(duì)200棵T0轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，共獲得65個(gè)陽(yáng)性株系，轉(zhuǎn)化率為19%。如圖2所示，10個(gè)T0轉(zhuǎn)基因再生苗中，L1和L35為陰性轉(zhuǎn)基因棉花，其余為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花。進(jìn)一步將獲得的T0陽(yáng)性棉花再生苗嫁接到溫室內(nèi)，其中有60株收獲到種子。

圖2 T0轉(zhuǎn)基因棉花PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of T0 generation of transgenic cotton

2.3 穩(wěn)定遺傳的后代轉(zhuǎn)基因棉花鑒定

2.3.1 T1、T2轉(zhuǎn)基因棉花鑒定對(duì)60個(gè)T1轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定（圖3），共得到48個(gè)T1的ST6-40轉(zhuǎn)基因棉花陽(yáng)性株系，其中，34個(gè)T1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的脯氨酸含量高于對(duì)照，且L2、L5、L14、L18、L22、L26、L29、L47共8個(gè)株系的脯氨酸含量顯著或極顯著高于對(duì)照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

對(duì)34個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花（圖3），其中31個(gè)的游離脯氨酸含量高于對(duì)照R15，且L2、L5、L14、L18、L22、L29、L55、L56共8個(gè)株系的脯氨酸含量顯著或極顯著高于對(duì)照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

圖3 T1～T3轉(zhuǎn)基因棉花在分子水平的鑒定Fig.3 Molecular identification of T1-T3 transgenic cotton lines PCR detection and qRT-PCR detection

表2 轉(zhuǎn)基因棉花的游離脯氨酸含量及苗期鹽脅迫下的鹽害指數(shù)Tab.2 Free proline content of transgenic cotton and salt damage index in seedling stage under salt stress

2.3.2 T3轉(zhuǎn)基因棉花鑒定T1、T2連續(xù)2代游離脯氨酸含量顯著高于受體對(duì)照R15的7個(gè)株系，繼續(xù)種植收獲T3種子，經(jīng)過(guò)對(duì)葉片噴草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，將植株葉片均抗草銨膦、且PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的株系確定為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性純合株系，共篩選出6個(gè)轉(zhuǎn)基因純合系（圖3）。

T3耐鹽鑒定共鑒定6個(gè)轉(zhuǎn)基因純合株系、1個(gè)常規(guī)耐鹽品系（中99807）及1個(gè)受體品系（R15），結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)基因株系及中99807鹽害指數(shù)均低于受體對(duì)照R15，其中轉(zhuǎn)基因株系L2、L5、L22、L29的鹽害指數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)基因受體對(duì)照R15，表明轉(zhuǎn)ST6-40基因棉花株系的耐鹽性比受體對(duì)照顯著提高。與常規(guī)耐鹽品系中99807相比，有4個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的鹽害指數(shù)較低，其中轉(zhuǎn)基因株系ST6-40-L2的鹽害指數(shù)顯著低于中99807。表明轉(zhuǎn)入ST6-40基因能有效提高棉花品種耐鹽性。

此外，對(duì)鹽脅迫下的植株生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，可以看出，在苗期和花鈴期轉(zhuǎn)基因棉花植株的生長(zhǎng)勢(shì)、萎蔫程度等方面均優(yōu)于受體對(duì)照品種（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因棉花苗期、花鈴期耐鹽鑒定Fig.4 Identification of salt tolerance during seedling and bell period of transgenic cotton

3 結(jié)論與討論

近10余年來(lái)，我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗逆棉花品種選育取得了重要進(jìn)展，挖掘了EDT1等一批能明顯提高棉花品種抗旱、耐鹽性的基因[10-11]。選育了一批轉(zhuǎn)基因抗旱耐鹽棉花新品種，為我國(guó)棉花抗逆育種提供了豐富的種質(zhì)資源。在棉花轉(zhuǎn)基因耐鹽育種研究方面，發(fā)掘了一批耐鹽基因，獲得了一些轉(zhuǎn)基因耐鹽棉花新材料，主要包括TsVP基因棉花、HcVP基因棉花、TaNHX2基因棉花等，以及擬南芥AtNHX1基因、大豆GmNHX1基因和百脈根LcVP1基因等。應(yīng)用較多的是與代謝相關(guān)的植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，主要包括甜菜堿CMO基因、大腸桿菌的beTA基因和小鹽芥ST6-40基因等[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥過(guò)量表達(dá)ST6-40基因，植物根系長(zhǎng)度、葉片及株高都有顯著提高[16-17]。本研究利用ST6-40基因構(gòu)建了重組載體pCB2004-ST6-40，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入棉花品種R15，共進(jìn)行了350個(gè)轉(zhuǎn)化事件，轉(zhuǎn)化率為19%，獲得65個(gè)陽(yáng)性T0株系，其中再生植株中90%為陽(yáng)性苗。轉(zhuǎn)化效率及陽(yáng)性率高于其他轉(zhuǎn)基因棉花，表明我們建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系高效穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)對(duì)葉片噴施草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)雙重篩選陽(yáng)性植株的方法，確保篩選鑒定出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性純合株系。

耐鹽鑒定基本采用測(cè)定游離脯氨酸、丙二醛等生理指標(biāo)來(lái)鑒定[18-20]，本研究為獲得穩(wěn)定的耐鹽轉(zhuǎn)基因棉花，對(duì)T1所獲得的48個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行游離氨基酸測(cè)定，發(fā)現(xiàn)34個(gè)的含量高于對(duì)照，進(jìn)一步對(duì)其T2鑒定，31個(gè)的含量高于對(duì)照，其中連續(xù)2代的游離脯氨酸含量均顯著高于對(duì)照的是L2、L5、L14、L18、L22、L29共6個(gè)株系。此外，利用鹽脅迫下棉花植株葉片受損程度來(lái)計(jì)算鹽害指數(shù)，該方法能夠較客觀地反映鹽脅迫下棉花植株的生長(zhǎng)狀況，篩選的的棉花材料在生產(chǎn)上適應(yīng)性更強(qiáng)[21-22]。本研究對(duì)前述6個(gè)株系的T3鑒定發(fā)現(xiàn)，均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因；且鹽害指數(shù)結(jié)果表明，L2、L22、L5、L29均優(yōu)于中99807，其中L2顯著優(yōu)于中99807，表明轉(zhuǎn)ST6-40基因棉花品系耐鹽性較強(qiáng)。因此，鑒定篩選的轉(zhuǎn)基因耐鹽品系生產(chǎn)適應(yīng)性更強(qiáng)[23]。

轉(zhuǎn)基因耐鹽育種作為一種高效的棉花耐鹽育種手段，本研究通過(guò)構(gòu)建pCB2004-ST6-40重組載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ST6-40基因轉(zhuǎn)入棉花基因組，經(jīng)耐鹽性鑒定，獲得耐鹽性顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因棉花株系，為棉花耐鹽育種創(chuàng)制了新的種質(zhì)材料，加快棉花耐鹽育種進(jìn)程。此外，基于該研究已經(jīng)申報(bào)并獲批了ST6-40-2等4個(gè)耐鹽性表現(xiàn)突出的ST6-40轉(zhuǎn)基因棉花株系的轉(zhuǎn)基因生物安全中間試驗(yàn)，下一步將利用雜交、回交等常規(guī)育種技術(shù)，進(jìn)一步改良這些材料的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀，為棉花耐鹽育種提供優(yōu)異種質(zhì)來(lái)源。