康立茹，劉 燕，楊永峰，王 永，王黎勝，劉湘萍，付崇毅，狄潔增，廉 勇，高 婧

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.烏拉特中旗水利局，內(nèi)蒙古 烏拉特中旗 015300；3.呼倫貝爾市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000）

1 大麗輪枝菌的生物學(xué)特性研究

1913年Klebahn首次從萎蔫的大麗花上分離得到了一株輪枝菌，并命名為大麗輪枝菌。隨著研究的不斷深入，研究人員先后從棉花[1]、向日葵[2]、馬鈴薯[3]、茄子[4]、番茄[5]、生菜[6]等作物上都分離得到大麗輪枝菌，據(jù)統(tǒng)計(jì)其寄主植物已多達(dá)660種，其中農(nóng)作物184種，觀賞植物323種，雜草153種；包含錦葵科、菊科、葫蘆科、茄科、豆科、十字花科等雙子葉植物。綜合分析，該菌菌絲體初期無(wú)色，后期加粗變褐，有隔膜，可以形成黑色微菌核。分生孢子梗輪枝狀，無(wú)色、直立，2～4輪生，每輪3～7個(gè)小枝，輻射狀。分生孢子著生在分生孢子梗的頂枝和分枝頂端，無(wú)色、卵圓形。微菌核由近球形的膨大細(xì)胞組成呈黑色，念珠狀或葡萄狀。大麗輪枝菌生長(zhǎng)所需要的最佳溫度為20~25℃，最適溫度為22.5℃，當(dāng)溫度升高至30℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，溫度高于35℃時(shí)停止生長(zhǎng)，60℃為致死溫度；大麗輪枝菌生長(zhǎng)最適的pH值為7.0～8.0，最適pH值為7.5；該菌最適碳源為蔗糖，最適氮源為硝態(tài)氮；最適宜的土壤類型為壤土，且當(dāng)土壤濕度小于30%時(shí)，隨著濕度的增加，病原菌的生長(zhǎng)速度加快；黑暗條件有利于大麗輪枝菌菌絲的生長(zhǎng)，也有利于產(chǎn)孢。

2 大麗輪枝菌的侵染過(guò)程研究

大麗輪枝菌在不利條件下或者沒(méi)有寄主存在時(shí)，病原菌以微菌核作為休眠結(jié)構(gòu)在土壤中存活數(shù)十年，待條件適宜時(shí)即可萌發(fā)形成菌絲，菌絲由根部傷口侵入寄主根系，進(jìn)入維管束后形成系統(tǒng)侵染，關(guān)于具體的侵染過(guò)程，不同寄主中存在一定差異，同一寄主的抗病和感病品種之間的差異非常顯著，其中用到的主要方法是綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記病原菌，可在藍(lán)色激發(fā)光下清晰可見(jiàn)[7]。如擬南芥[8]，接菌6 h分生孢子吸附在根表面，2～3 d到達(dá)皮層，9 d到達(dá)維管束，隨后迅速擴(kuò)展，11 d后完成系統(tǒng)侵染，并產(chǎn)生黃萎病癥狀。對(duì)于寄主棉花[9]而言，這一研究比較詳細(xì)。同一菌株在對(duì)抗黃萎病棉花品種和感黃萎病棉花品種的侵染過(guò)程中，從孢子萌發(fā)、進(jìn)入維管束時(shí)間等各個(gè)過(guò)程均推遲2～5 d不等，如分生孢子萌發(fā)時(shí)間，感病品種中吸附孢子24 h開(kāi)始萌發(fā)，抗病品種中孢子萌發(fā)則在第5 d，推遲了4 d；再如菌絲進(jìn)入維管組織時(shí)間在感病品種中是第7 d，在抗病品種中是第10 d，推遲了3 d；同樣時(shí)間內(nèi)抗感品種發(fā)病的嚴(yán)重程度也不同，接菌14 d后，感病棉株葉片已經(jīng)產(chǎn)生萎蔫和褪綠癥狀，抗病品種只是子葉褪綠真葉毫無(wú)癥狀，莖基部分離到的菌落數(shù)也遠(yuǎn)少于感病品種。向日葵作為黃萎病的寄生對(duì)象，接種24 h孢子萌發(fā)，3 d菌絲突破表皮細(xì)胞造成內(nèi)部侵染，菌絲在進(jìn)入須根導(dǎo)管中需要5 d時(shí)間，若進(jìn)入主根的導(dǎo)管則需要7 d。

此外，對(duì)大麗輪枝菌侵染過(guò)程研究有借鑒和指導(dǎo)意義的還涉及多種病原菌，多種作物，如枯萎病菌對(duì)香蕉的侵染[10]、枯萎病菌對(duì)向日葵的侵染、稻瘟病菌對(duì)水稻的侵染[11]、立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯的侵染[12]等。王凱等人[13]研究了大麗輪枝菌在感黃萎病馬鈴薯品種云薯301中的侵染過(guò)程，認(rèn)為24 h孢子萌發(fā)形成菌絲體，7 d菌絲擴(kuò)展至根部皮層，14 d進(jìn)入芽眼根的維管組織，3周莖基部觀察到大量菌絲，這些菌絲可以橫向生長(zhǎng)進(jìn)入相鄰細(xì)胞，6～7周時(shí)，病原菌侵入至植株上部葉片、匍匐莖和塊莖維管組織，10周后整株死亡。

3 大麗輪枝菌的種子帶菌研究

眾所周知，大麗輪枝孢菌常常以分生孢子或微菌核的形式通過(guò)病殘?bào)w、發(fā)病土壤、耕作農(nóng)具、灌溉水等傳播媒介進(jìn)行傳播[14]。但隨著大麗輪枝菌侵染過(guò)程的研究，更多的植物組織和器官可以被大麗輪枝菌侵染和定殖，由此成為病原菌的傳播介體，其中跟隨種子傳播就是重要的途徑之一，這也給病原菌的防控提供了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。如在棉花的種子傳菌研究中，Gre M E等[15]對(duì)29份不同品種棉花種子帶菌情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同品種帶菌率存在一定差異，帶菌率在0～29.8%，選取帶菌種子再次種植，13周后植株出現(xiàn)典型的黃萎病癥狀。向日葵種子帶菌研究比較詳細(xì)，張園園[16]根據(jù)侵染過(guò)程觀察和MNP-10培養(yǎng)基快速檢測(cè)體系都證明了種皮、種殼可以攜帶病原菌，其中種皮是最重要的部位。在此之前，付劍樺[17]也證明了這一點(diǎn)，但是都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)種胚可以帶菌。張貴等[18]同樣研究過(guò)向日葵種子帶菌情況，他首先以7個(gè)向日葵品種種皮DNA為模板,利用真菌通用引物ITS1/ITS4和ITS區(qū)內(nèi)側(cè)的黃萎菌特異引物進(jìn)行巢氏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR），證明了種皮攜帶黃萎病菌，隨后用同樣的方法對(duì)另外9個(gè)品種種子帶菌情況檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)種皮帶菌率在10%～25%。2005年Vallad GE等[19]對(duì)被大麗輪枝菌侵染的生菜植株進(jìn)行收種，收集的種子，種子表面消毒后在NP-10培養(yǎng)基中鑒定帶菌情況，部分品種種子帶菌率高達(dá)90%，種子再次種植植株發(fā)病率在55%～80%。3年后他對(duì)種子帶菌部位進(jìn)行準(zhǔn)確定位，在觀察大麗輪枝菌在抗感生菜品種中侵染過(guò)程的研究中發(fā)現(xiàn)，生菜種子帶菌部位主要有冠毛、果皮、被皮和胚乳，但是種胚不能被病原菌侵染而帶菌。此外相關(guān)研究也證明了大麗輪枝菌可感染南瓜種子，帶菌率在6%～28%，收獲后的種子再次播種，有25%的幼苗攜帶大麗輪枝菌。大麗輪枝菌還可侵染茄子、番茄等多種作物種子，從而進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。

4 大麗輪枝菌的致病機(jī)制研究

關(guān)于黃萎病菌的致病機(jī)制，歷年來(lái)有多種解釋，其中大多以“導(dǎo)管堵塞”和“毒素”兩種學(xué)說(shuō)為主。研究人員通過(guò)對(duì)黃萎病菌侵染棉花過(guò)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)含有菌絲、膠狀物、侵填體維管束的數(shù)量與發(fā)病的嚴(yán)重程度正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，橄欖被黃萎病菌侵染后，木質(zhì)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，菌絲體在維管束中繁殖，維管束中形成的侵填體以及聚集物堵塞木質(zhì)部?jī)?nèi)腔，木質(zhì)部的堵塞程度與葉片的發(fā)生的程度呈現(xiàn)正相關(guān)[20]。因此，早期的研究認(rèn)為，黃萎病是因?yàn)閷?dǎo)管被堵塞從而導(dǎo)致發(fā)病植株的萎蔫和壞死。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，即使將莖部維管束切去一半，植物也不會(huì)萎蔫，而且被堵塞的導(dǎo)管數(shù)占整個(gè)維管束的比例較小，因此認(rèn)為導(dǎo)管堵塞不是導(dǎo)致棉花萎蔫的主要原因[21]。隨著研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到黃萎病菌產(chǎn)生的毒素可能是導(dǎo)致植物萎蔫的重要因素。還有一些學(xué)者認(rèn)為，維管束的堵塞也是基于毒素的誘導(dǎo)效應(yīng)[22]。

近年來(lái)，通過(guò)T-DNA隨機(jī)插入突變、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化（ATMT）等技術(shù)被廣泛應(yīng)用，黃萎病菌的一些致病相關(guān)基因相繼被發(fā)現(xiàn)，如促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）VMK1基因、富含谷氨酸的蛋白VdGARP1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Sgel基因等，這些基因可通過(guò)調(diào)控代謝途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑響應(yīng)病原菌的侵染。尤其是在基因突變的研究中發(fā)現(xiàn)，一些與微菌核產(chǎn)生有關(guān)的基因突變會(huì)導(dǎo)致其致病力的顯著降低，如轉(zhuǎn)錄因子VdSge1、Vta、VdCrz1、VdMcm1；蛋白激酶VMK1、VdSNF、VdPbs2、VdPKAC1；葡萄糖代謝調(diào)節(jié)基因VdEg-1、VdHMGS、VdGPIM3等。張鍵[23]通過(guò)對(duì)VdOCH1、VdAAD2個(gè)基因的敲除和互補(bǔ)突變，認(rèn)為這兩個(gè)基因不僅與大麗輪枝菌細(xì)胞壁的完整性有關(guān)，還能夠調(diào)節(jié)病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育、微菌核的形成、粗毒素分泌，從而影響大麗輪枝菌的致病力。劉軒[24]通過(guò)敲除大麗輪枝菌編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因Vd Sch9對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)敲除突變體對(duì)于高滲透壓、氧化還原壓力、細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞壁完整性等壓力條件的敏感性增強(qiáng)。影響這大麗輪枝菌的生長(zhǎng)發(fā)育及侵染過(guò)程。李俊嬌[25]研究了大麗輪枝菌VdSho1的分子機(jī)制，認(rèn)為該基因作為膜感受器參與感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓變化,進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)菌絲內(nèi)部黑色素的水平而提高病原菌穿透能力,最終調(diào)節(jié)大麗輪枝菌致病性。劉世超[26]對(duì)棉花大麗輪枝菌GH28家族成員VdEPG1的基因功能進(jìn)行了研究，認(rèn)為VdEPG1可能參與由GhOPR9介導(dǎo)的茉莉酸合成路徑，誘導(dǎo)寄主免疫抗性,為后續(xù)棉花的抗病育種提供新的理論依據(jù)。