邵俊蘭 范文華 焦小雨 丁 蕾 項(xiàng)良華 唐春雷

(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214000)

肺動(dòng)脈高壓指的是在海平面、靜息狀態(tài)下，經(jīng)右心導(dǎo)管測(cè)量的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)≥3.33 kPa(25 mm Hg)，最終可致患者右心功能衰退和死亡。我國(guó)肺動(dòng)脈高壓患者的3年生存率為39%，5年生存率僅為21%[1]。因此，抗肺動(dòng)脈高壓藥物的研制與工藝改進(jìn)仍是藥物研發(fā)工作的熱點(diǎn)。

Selexipag(化合物1，結(jié)構(gòu)式見圖1，商品名Uptravi，又稱賽樂西帕、司來(lái)帕格)，其化學(xué)名稱為2-[4-[N-(5,6-二苯基哌嗪-2-基)-N-異丙基氨基]丁氧基]-N-(甲磺?；?乙酰胺，由瑞士愛可隆(Actelion)生物制藥公司和日本新藥株式會(huì)社聯(lián)合研發(fā)，新藥申請(qǐng)于2015年12月21日獲美國(guó)FDA審評(píng)[2]。Selexipag是一種口服有效、高選擇性和長(zhǎng)效的前列環(huán)素(IP)受體激動(dòng)劑，可松弛血管壁平滑肌，改善損傷的肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張。2015年《歐洲肺動(dòng)脈高壓診治指南》[3]和2018年《中國(guó)肺高血壓診斷和治療指南》[4]皆建議，應(yīng)使用Selexipag治療心功能分級(jí)為Ⅱ或Ⅲ級(jí)的肺動(dòng)脈高壓患者。2021年7月30日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Selexipag靜脈注射劑(Uptravi IV)用于治療目前已處于口服療法階段，但暫時(shí)無(wú)法接受口服療法，WHO功能分級(jí)Ⅱ-Ⅲ的肺動(dòng)脈高壓成人患者[5]。2021年12月7日，Selexipag由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)口注冊(cè)，用于成人肺動(dòng)脈高壓治療。

圖1 Selexipag的結(jié)構(gòu)

原研公司文獻(xiàn)報(bào)道了Selexipag的合成路線[6，7]，如圖2所示。路線1包括以下步驟：(1)以4-氨基-1-丁醇(化合物2)為起始原料，在氧化鉑催化下，進(jìn)行高壓還原縮合得到4-異丙基氨基-1-丁醇(化合物3)；(2)化合物3和2-氯-5,6-二苯基吡嗪(化合物4)在190 ℃下高溫縮合，得到中間體4-(N-(5,6-二苯基吡嗪基)-N-異丙基氨基)-1-丁醇(化合物5)；(3)化合物5與溴乙酸叔丁酯發(fā)生縮合反應(yīng)，得到2-(4-(N-(5,6-二苯基吡嗪基)-N-異丙基氨基)正丁氧基)乙酸叔丁酯(化合物6)；(4)化合物6水解脫去叔丁酯基，得到 2-(4-(N-(5,6-二苯基吡嗪基)-N-異丙基氨基)正丁氧基)乙酸(化合物7)；(5)化合物7先與N,N′-羰基二咪唑(CDI)反應(yīng)，然后在 1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)存在下與甲基磺酰胺發(fā)生?；磻?yīng),得到終產(chǎn)物Selexipag。

圖2 Selexipag的合成路線1

原研專利的合成路線步驟為5步反應(yīng)，該路線存在以下缺點(diǎn)：步驟(1)高壓氫化,反應(yīng)能耗大，工業(yè)化需要特殊設(shè)備，風(fēng)險(xiǎn)較高；步驟(2)需要190 ℃反應(yīng)10 h，條件苛刻且存在安全隱患，同時(shí)2-氯-5,6-二苯基哌嗪較為昂貴且不易得到，增加了工藝成本，并且由于2-氯-5,6-二苯基哌嗪反應(yīng)活性較低，此步收率僅有56%；步驟(3)中氫氧化鉀固體在苯溶液中難溶，中間體5反應(yīng)不完全；步驟(5)中縮合劑CDI對(duì)濕氣非常敏感，遇水易分解，反應(yīng)對(duì)溶劑水分要求高；步驟(1)、(2)、(4)、(5)都需要硅膠柱色譜純化，成本高，效率低，三廢嚴(yán)重。綜上，整個(gè)合成路線成本高且收率低，總摩爾收率僅為26%，反應(yīng)操作難度大,安全性上也不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化推廣。

鑒于以上路線的缺陷，作者通過(guò)對(duì)起始原料、合成路線、后處理方法進(jìn)行改造和優(yōu)化，確定了較優(yōu)的合成工藝(圖3)。此工藝由4-氯-1-丁醇和異丙胺合成中間體3，以5,6-二苯基-2-羥基吡嗪(化合物8)為原料，通過(guò)取代反應(yīng)得到中間體9。中間體9和中間體3通過(guò)縮合反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體5，再通過(guò)縮合、水解、?；椒磻?yīng)得到目標(biāo)化合物1。改進(jìn)后的工藝路線總收率由原來(lái)的26.00%提升至40.70%。

圖3 Selexipag的合成路線2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

LCMS-8080液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；LC1260 色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Bruker AVIII-400MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司，溫度未經(jīng)校正)；低溫恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；紫外線分析儀(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純，未進(jìn)一步純化。

1.2 合成部分

1.2.1 4-(異丙氨基)丁醇(3)的制備

在500 mL反應(yīng)瓶中加入60.00 g(0.56 mol)4-氯-1-丁醇、131.23 g(2.22 mol)異丙胺，油浴加熱至60 ℃反應(yīng)6 h。高效液相色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，冷卻至室溫，向反應(yīng)液中緩慢加入150 mL濃度為2 mol·L-1的鹽酸溶液，調(diào)至pH=2,用二氯甲烷(200 mL)洗滌，水相加150 mL濃度2 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至pH=11，用二氯甲烷(60 mL×3)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得60.58 g黃色透明油狀產(chǎn)物4-(異丙氨基)丁醇(3)，收率82.50%。ESI-MS m/z：132.1[M+H]+。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d)δ：4.14(s,1H),3.43 (t,J=5.4 Hz, 2H), 3.32 (s, 1H),2.67 (p,J=6.3 Hz, 1H), 2.49 (t,J=5.8 Hz, 2H)，1.54～1.42 (m, 4H), 0.94 (d,J=6.4 Hz, 6H)。

1.2.2 2-溴-5,6-二苯基吡嗪(9)的制備

在500 mL反應(yīng)瓶中加入50.00 g(0.20 mol)5,6-二苯基-2-羥基吡嗪(8)，溶于300 mL無(wú)水二氯甲烷中，室溫?cái)嚢柘?，向其中緩慢加?4.26 g(0.24 mol)三溴化磷，反應(yīng)5 min后升溫至回流，反應(yīng)1.5 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全(展開劑為石油醚-乙酸乙酯，體積比10∶1,Rf=0.8)。冷卻至室溫，減壓旋蒸除去二氯甲烷，再加入乙酸乙酯(100 mL)、冰水(40 mL)，用乙酸乙酯(100 mL×3)萃取，合并有機(jī)相，依次用冷卻的碳酸氫鈉溶液(100 mL)、水(100 mL)、飽和鹽水(200 mL×2)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，得到灰色固體即2-溴-5,6-二苯基吡嗪的粗品。然后用石油醚(30 mL)打漿0.5 h，抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥箱干燥2 h，得到白色固體2-溴-5,6-二苯基吡嗪(9)59.06 g，收率為95.26%。熔點(diǎn)：138.1～140.7 ℃，ESI-MS m/z：311.0[M+H]+，1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.91(s, 1H), 7.50～7.23 (m, 10H)。

1.2.3 4-(N-(5,6-二苯基吡嗪-2-基)-N-異丙基氨基)-1-丁醇(5)的制備

向250 mL反應(yīng)瓶中依次加入58.00 g(0.19 mol)2-溴-5,6-二苯基吡嗪(9)、73.60 g(0.56 mol)4-異丙基氨基-1-丁醇(3)和8.29 g(0.05 mol)碘化鉀，加熱至120 ℃反應(yīng)6 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束且副產(chǎn)物較少(展開劑為石油醚-乙酸乙酯，體積比10∶1,Rf=0.8)。將反應(yīng)液降溫至100 ℃，反應(yīng)液由褐色變黃，加入水(200 mL)，用乙酸乙酯(200 mL×2)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液經(jīng)減壓濃縮得N-(5,6-二苯基吡嗪-2-基)-N-異丙基氨基)-1-丁醇粗品。用石油醚/乙酸乙酯(30 mL，體積比15∶1)混合溶劑打漿，得44.70 g 淡黃色粉末狀固體4-(N-(5,6-二苯基吡嗪-2-基)-N-異丙基氨基)-1-丁醇(5)，收率65.13%。熔點(diǎn)：101.8～103.2 ℃，ESI-MS m/z：362.2[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.14 (s, 1H), 7.38 (dd,J=7.3, 2.4 Hz, 2H), 7.31～7.19 (m, 8H), 4.79 (h,J=6.7 Hz, 1H), 4.49 (t,J=5.1 Hz, 1H), 3.52～3.39 (m, 4H), 1.67 (p,J=8.1, 7.4 Hz, 2H), 1.54 (p,J=6.7 Hz, 2H), 1.23 (d,J=6.7 Hz, 6H)。

1.2.4 2-(4-(N-(5,6-二苯基吡嗪基)-N-異丙基氨基)丁氧基)乙酸叔丁酯(6)的制備

向500 mL反應(yīng)瓶中依次加入44 g(0.12 mol)中間體5、200 mL甲苯、7.74 g(0.024 mol)四丁基溴化銨和150 mL 40%的氫氧化鉀溶液，加畢，攪拌10 min, 繼續(xù)滴加46.8 g(0.24 mol)溴乙酸叔丁酯，室溫反應(yīng)1 h。薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全(展開劑為石油醚-乙酸乙酯，體積比3∶1，Rf=0.7)，旋蒸除去甲苯(可回收)，濃縮后的反應(yīng)液用水(200 mL×2)洗滌，乙酸乙酯萃取(150 mL×3)，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮得到52.86 g淡黃色油狀產(chǎn)物 2-(4-((5,6-二苯基吡嗪基)(異丙基)氨基)丁氧基)乙酸叔丁酯)(6)粗品，收率91.3%。ESI-MS m/z：476.3[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：8.14 (s, 1H), 7.38～7.35 (m, 2H), 7.29 (d, J=3.3 Hz, 2H), 7.28～7.20 (m, 6H), 3.95 (s, 2H), 3.47 (dt, J=28.3, 7.3 Hz, 5H), 2.00 (d, J=7.8 Hz, 2H), 1.63 (d, J=8.9 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.23 (s, 6H)。無(wú)需純化直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.5 2-(4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)(異丙基)氨基)丁氧基)乙酸(7)的制備

向500 mL反應(yīng)瓶中依次加入52 g(0.11 mol)中間體6，300 mL乙醇，升溫至40℃，開始滴加濃度為2 mol·L-1的 NaOH溶液(200 mL)，滴畢，將反應(yīng)體系升溫至回流溫度，反應(yīng)45 min，薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑為二氯甲烷-甲醇，體積比15∶1，Rf=0.5)，濃縮至無(wú)液體滴出，得膠狀物14.2 g，將此膠狀物溶解在500 mL水中，滴加濃度為2 mol·L-1的稀鹽酸至淡黃色固體全部析出，此時(shí)pH為5～6，過(guò)濾，濾餅于40 ℃真空干燥箱干燥2 h，用150 mL異丙醇重結(jié)晶，得42.43 g黃色粉末狀產(chǎn)物2-(4-((5,6-二苯基吡嗪-2-基)(異丙基)氨基)丁氧基)乙酸(7)，收率92.5%。熔點(diǎn)：112.9～114.2 ℃，ESI-MS m/z：418.2[M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：12.78 (s, 1H), 8.14 (d,J=6.4 Hz, 1H), 7.39～7.35 (m, 2H), 7.31～7.24 (m, 6H), 7.22 (d,J=5.3 Hz, 2H), 4.79 (qt,J=8.4, 5.7, 5.2 Hz, 1H), 4.06～4.00 (m, 2H), 3.51 (dt,J=11.8, 6.1 Hz, 2H), 3.44 (dd,J=9.7, 5.6 Hz, 2H), 1.70～1.51 (m, 4H), 1.23 (d,J=6.5 Hz, 6H)。無(wú)需純化直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.6 Selexipag的制備

向500 mL反應(yīng)瓶中依次加入41.90 g(0.10 mol)中間體7，300 mL N,N-二甲基甲酰胺、24.32 g(0.18 mol)1-羥基苯并三唑(HOBT)、34.51 g(0.18 mol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和14.25 g(0.15 mol)甲基磺酰胺，開啟攪拌，室溫反應(yīng)5 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全(展開劑為二氯甲烷-甲醇，體積比10∶1，Rf=0.8)，將反應(yīng)液濃縮除去部分溶劑，剩余物緩慢加入冰水中，析出固體,過(guò)濾，收集濾餅，于40 ℃真空干燥箱干燥2 h，得到Selexipag粗品。用二氯甲烷-正庚烷(400 mL,體積比1∶5)重結(jié)晶，加熱回流溶解固體，冷凝分出100 mL混合溶劑，溶液仍澄清，降溫至10 ℃ 左右有晶體析出，抽濾，濾液重復(fù)以上精制步驟兩次，合并濾餅得40.42 g白色粉末狀固體產(chǎn)物Selexipag，收率81.5%，純度99.44%[HPLC面積歸一化法，色譜柱：Ultimate C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相A:體積分?jǐn)?shù)0.05%的甲酸水溶液；流動(dòng)相 B：乙腈；梯度洗脫：0～1 min 90% A,10% B；1～5 min 90% A→50% A,10% B→50% B;5～15 min 50% A,50% B;15～20 min 50% A→10% A,50% B→90% B;20～25 min 10% A，90% B;25～40 min 10% A→90% A；90% B→10% B。檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm；流速:0.5 mL·min-1；柱溫:25 ℃]。熔點(diǎn)：138.1～140.7 ℃，ESI-MSm/z：497.3[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：11.78 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.43～7.38 (m, 2H), 7.34～7.21 (m, 8H), 4.80 (p,J=6.7 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.57 (t,J=5.9 Hz, 2H), 3.45 (d,J=8.4 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 1.75～1.63 (m, 4H), 1.24 (d,J=6.7 Hz, 6H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 中間體5的工藝條件考察

2.1.1 溫度和時(shí)間的考察

4-(N-(5,6-二苯基吡嗪-2-基)-N-異丙基氨基)-1-丁醇(5)作為制備Selexipag的重要中間體，其收率和純度很大程度上影響了終產(chǎn)物的收率和純度。作者考察了30、 60、90、120、150、180 ℃等溫度下的反應(yīng)情況，結(jié)果顯示，在低溫下反應(yīng)很慢，通常要反應(yīng)15 h以上，高溫下會(huì)生成雜質(zhì)S，結(jié)構(gòu)見圖4，最終確定以120 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 雜質(zhì)S的結(jié)構(gòu)

作者考察了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響(圖5)。采用HPLC跟蹤反應(yīng)，結(jié)果顯示，6 h左右反應(yīng)基本結(jié)束，轉(zhuǎn)化率不再隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，經(jīng)HPLC面積歸一法分析其含量也沒有太大的變化，優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間6 h 為宜。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.2 對(duì)不同縛酸劑的考察

作者考察了縛酸劑對(duì)反應(yīng)收率的影響，結(jié)果如表1所示，表明使用碘化鉀做縛酸劑收率最高。

表1 不同的縛酸劑對(duì)中間體5收率的影響

2.1.3 后處理方法的考察

在對(duì)中間體5的后處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，中間體5在石油醚-乙酸乙酯(PE-EA)的溶液體系中溶解性不佳，尋找最佳的二元溶劑配比使純度與收率達(dá)到平衡，從而避免繁瑣的柱層析操作，不同比例的二元溶劑打漿對(duì)中間體5純度與收率影響如表2所示。

由表2可以看出，當(dāng)打漿溶劑比例控制在PE∶EA為15∶1時(shí)，中間體5經(jīng)HPLC檢測(cè)純度達(dá)到99.4%，并且打漿之后的收率也相對(duì)其他比例的溶劑更高，因此選擇PE∶EA=15∶1作為純化化合物5的打漿溶劑。

表2 不同比例的二元溶劑打漿對(duì)中間體5純度與收率的影響

2.2 中間體6的制備條件考察

該步反應(yīng)考察相轉(zhuǎn)移催化劑(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1～4)和堿(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1，5～9)對(duì)反應(yīng)收率的影響，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明，以四丁基溴化銨(TBAB)作相轉(zhuǎn)移催化劑，氫氧化鉀(KOH)溶液作堿時(shí)，反應(yīng)收率最高，為91.3%。

表3 合成中間體6的影響因素?cái)?shù)據(jù)

2.3 化合物1的制備條件考察

考察了影響反應(yīng)的溶劑(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1～4)、化合物7與甲基磺酰胺的投料比(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1，5～11)、縮合劑(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組1，9～11)等因素?？刂茊我蛔兞窟M(jìn)行多次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 合成化合物1的影響因素?cái)?shù)據(jù)

確定最優(yōu)條件為：投料比n化合物7∶n甲基磺酰胺為1∶1.5，縮合劑采用EDCI/HOBt體系，室溫反應(yīng)5 h，收率為81.5%。

3 結(jié)論

本研究對(duì)Selexipag的各步反應(yīng)條件進(jìn)行初步探索，優(yōu)化了合成方法。第一步中4-(異丙氨基)丁醇(3)的合成與文獻(xiàn)報(bào)道的高壓氫化不同，實(shí)驗(yàn)采用無(wú)溶劑法反應(yīng)，后處理簡(jiǎn)便，反應(yīng)相對(duì)溫和，降低反應(yīng)能耗。中間體5采用價(jià)廉易得的5,6-二苯基-2-羥基吡嗪為起始原料經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)得到，收率由原文獻(xiàn)的56%提升至67%。中間體6的縮合反應(yīng)中，引入相轉(zhuǎn)移催化劑TBAB提高反應(yīng)收率。目標(biāo)產(chǎn)物Selexipag的后處理無(wú)需萃取，加水降溫即可析出。作者對(duì)關(guān)鍵中間體5、6和目標(biāo)終產(chǎn)物的制備條件進(jìn)行了研究，具體包括反應(yīng)溶劑、時(shí)間、溫度、投料比、催化劑、縮合劑等因素，反應(yīng)產(chǎn)物均采用打漿或重結(jié)晶的方式純化，避免柱層析分離，節(jié)約成本，便于放大生產(chǎn)，總收率提升至40.70%(以5,6-二苯基-2-羥基吡嗪為基準(zhǔn)計(jì)算)。研究路線安全環(huán)保，簡(jiǎn)單溫和，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，產(chǎn)物收率高，純度高，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景，可為Selexipag的生產(chǎn)及其衍生物的合成提供參考。