吳 玲

(1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗檢測認(rèn)證學(xué)院，江蘇常州 213164；2.南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210023)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及在人類活動的影響下，重金屬引起的土壤污染問題越來越嚴(yán)重。重金屬污染物易積累、難降解且毒性大，能夠破壞土壤生態(tài)環(huán)境及土壤結(jié)構(gòu)，使土壤變得貧瘠，并導(dǎo)致土壤肥力下降[1]。土壤中的重金屬主要來源于風(fēng)化作用、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)化學(xué)物的排放以及空氣中有毒氣體在雨水沖刷下與土壤的混合作用[2]；同時，土壤中的重金屬還能通過滲透作用回到周圍的大氣與水體中[3]。我國是水稻種植大國，水稻土遭受不同程度及不同種類的重金屬污染，其中，鎘生物毒性極強(qiáng)，是土壤中較為常見的重金屬污染元素，能夠被稻米富集，因此受到廣泛關(guān)注[4-5]。

土壤微生物能夠參與C、N等多種營養(yǎng)元素的循環(huán)過程，在維持土壤結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了重要的作用，高豐度的土壤微生物群落對于維持土壤功能具有重要的作用[6]。在重金屬的脅迫下，土壤中微生物量及活菌菌落數(shù)量明顯下降，且土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生變化[7-8]。研究表明，與其他生物相比，土壤微生物對重金屬更加敏感，重金屬污染能夠干擾土壤微生物的生長、形態(tài)和代謝[9]。Ros等研究證實，Cd污染能影響半干旱土壤中的微生物活性、群落豐度與群落結(jié)構(gòu)[10]；大量的室內(nèi)與野外試驗證實，重金屬Cd能夠影響土壤微生物，并對土壤微生物產(chǎn)生最強(qiáng)烈的副作用，且不同的微生物對重金屬Cd具有不同的耐受性，微生物群落結(jié)構(gòu)同時也是指示土壤重金屬污染的重要指標(biāo)[11-12]。水稻土是具有干濕交替特征的特殊的農(nóng)田土壤，研究不同濃度Cd對水稻土中土著細(xì)菌群落的影響是篩選土著耐Cd細(xì)菌的前提和基礎(chǔ)，而耐重金屬菌株的篩選是研究土壤微生物修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。因此，本研究結(jié)果對當(dāng)?shù)赝寥乐亟饘傩迯?fù)具有重要意義[13]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集0～15 cm深度的自然生態(tài)系統(tǒng)土壤作為供試土，去除表面落葉、植被及顆粒物后，將土壤置于室內(nèi)自然風(fēng)干后研磨過篩，備用。

1.2 水稻盆栽試驗設(shè)置

在15 cm×20 cm(R×H)的塑料盆中裝土約 2 kg，將一定濃度的CdCl2·2.5H2O溶液加入盆中與土混合均勻，配制成Cd終濃度分別為0、20、40、80、160 mg/kg的土壤，每個濃度設(shè)置6個平行。在土壤中以1 ∶1 ∶1(質(zhì)量比)施入N-P2O5-K2O肥料并澆水使土潤濕，放置平衡2周。2019年5月初在江蘇武進(jìn)水稻研究所(中國常州)實驗室進(jìn)行水稻育苗，選取苗齡2周，生長一致的秧苗移栽至塑料盆，放置于常州工程職業(yè)學(xué)院(中國常州)知行樓頂樓露臺，接受自然光照，用自來水澆灌，盆中保持 3～5 cm水層，模擬水稻150 d左右的生長周期。

1.3 水稻根際與非根際土的采集

在水稻生長的成熟期進(jìn)行破壞性采樣，采集不同Cd含量(0、20、40、80、160 mg/kg)的根際與非根系水稻土共10個樣品，每個樣品采集3個平行樣。根據(jù)文獻(xiàn)，采用抖落法收集區(qū)分根際土和非根際土[14]。將采集的水稻根際與非根際土壤一部分用于土壤理化指標(biāo)分析，一部分用于分子生態(tài)學(xué)研究。

1.4 水稻土理化性質(zhì)的測定

pH值的測定：按2.5 ∶1的水土比用蒸餾水浸提水稻土，振蕩10 min并靜置30 min，用Mettler-Toledo S220-K-CN臺式pH計測定懸濁液pH值；無機(jī)氮的測定：按5 ∶1的水土比用2 mol/L KCl提取，并用Skalar San Plus連續(xù)流動分析儀(荷蘭Skalar分析儀器公司)測定無機(jī)氮的濃度；采用凱氏(Micro-Kjeldahl)定氮法測定總氮(total nitrogen，TN)含量；采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定總有機(jī)碳(total organic carbon，TOC)含量[15]。

1.5 宏基因組DNA的提取

采用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)，參照使用說明書，將新鮮的水稻土樣品混勻，提取宏基因組DNA，并測定其濃度與純度。

1.6 高通量測序

使用通用引物515F(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G-3′)和907R(5′-C C G T C A A T T C M T T T R A G T T T-3′)對水稻土中原核微生物16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠分離，委托上海美吉生物(中國上海)進(jìn)行高通量測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0軟件通過單因素方差分析(One-way analysis of variance)和Tukey多重比較評估不同Cd含量的水稻土理化指標(biāo)之間的差異，P<0.05表示數(shù)據(jù)之間有顯著差異。利用美吉生信云平臺(http：//cloud.majorbio.com)將測序得到的OTU序列進(jìn)行在線分析，主要包括微生物群落結(jié)構(gòu)分析，香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Sobs指數(shù)及文庫覆蓋率(Coverage)的計算，水稻土Cd含量、理化指標(biāo)與綱水平主要細(xì)菌類群豐度的Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cd含量的水稻土理化指標(biāo)分析

2.2 不同Cd含量的水稻土高通量測序結(jié)果初步分析

不同Cd含量的水稻土中微生物16S rRNA基因Illumina高通量測序結(jié)果如表2所示， 10個水稻土樣品共獲得1 313 418條有效序列，且序列平均長度分別為376 bp。

表1 水稻根際與非根際土理化指標(biāo)

表2 基于16S rRNA基因的水稻土樣品高通量測序結(jié)果

由OUT水平的Sobs稀釋曲線可得，水稻土樣品中的16S rRNA基因高通量測序所得的Sobs指數(shù)平均值在1 496～2 468之間，稀釋曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理(圖1-a)；Shannon指數(shù)表示菌群多樣性指數(shù)，數(shù)值越大，微生物多樣性越高，基于16S rRNA基因測序結(jié)果的Shannon指數(shù)在4.69～6.40之間，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足以反映水稻土樣品中大部分微生物的多樣性信息(圖 1-b)，且隨著水稻土中Cd濃度的上升，RS-160水稻樣品Shannon指數(shù)明顯低于其他組。Coverage值在0.97～0.98之間，說明測得的OTU基本能夠反映水稻土樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成(表2)。

2.3 不同Cd含量的水稻土中微生物群落結(jié)構(gòu)變化與多樣性分析

對高通量測序獲得的所有OUT序列進(jìn)行界(Kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)水平上的物種分類。通過16S rRNA基因測序結(jié)果可知，不同Cd含量的水稻土樣品中的原核微生物主要為細(xì)菌界，共有35個門，相對豐度前11位的細(xì)菌類群包括變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、己科河菌門、匿桿菌門，其中變形菌門在各水稻土樣品中均表現(xiàn)出優(yōu)勢，其在水稻土樣品中的相對豐度平均值在32.1%～41.9%之間；共有94個綱，相對豐度前10位優(yōu)勢菌群包括γ-變形菌綱、放線菌綱、subgroup-6、α-變形菌綱、擬桿菌綱、厭氧繩菌綱、δ-變形菌綱、生氧光細(xì)菌綱、梭菌綱、芽單胞菌綱(圖2)。

2.4 不同Cd含量的水稻土中微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響因素

3 討論與結(jié)論

土壤細(xì)菌是土壤中最重要的類群，對土壤中的重金屬污染物十分敏感[16-17]。當(dāng)土壤中重金屬的濃度較高時，有些細(xì)菌數(shù)量會減少或絕滅，但耐重金屬細(xì)菌數(shù)量會增加并累積，因此，長期遭受重金屬污染的土壤細(xì)菌的群落數(shù)量與結(jié)構(gòu)可能發(fā)生顯著的變化[18]。本研究通過基于16S rRNA基因的高通量測序技術(shù)分析可得，不同Cd含量的水稻土中原核微生物主要為細(xì)菌界以及其下35個門和94個綱，Sobs指數(shù)平均值在1 496～2 468之間，Shannon指數(shù)分布在4.69～6.40之間。由不同Cd含量的水稻土中門水平微生物群落分布圖可知，變形菌門在各水稻土樣品中均表現(xiàn)出優(yōu)勢，并以γ-變形菌綱為主，其次為α-變形菌綱與δ-變形菌綱。變形菌門大多數(shù)兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活，俎千惠等對不同緯度地區(qū)水稻土細(xì)菌群落的研究顯示，不同緯度的8個典型地區(qū)的水稻土均以變形菌門中的α和β分支為主[19]。