王新亮， 彭 玲， 王 健， 賈晶晶， 唐立平

(1.濱州學院學報編輯部，山東濱州 256603； 2.濱州學院山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點實驗室，山東濱州 256603)

土壤鹽堿化是影響植物生長的重要環(huán)境因子。據(jù)統(tǒng)計，全球約有 95 000萬hm2的鹽堿地，占世界總陸地面積的7%以上[1]，預(yù)計至2050年將會有50%以上的耕地發(fā)生鹽堿化[2]。我國鹽堿地總面積約有 9 900萬hm2[3]，主要分布在東北松嫩平原、東部濱海沿岸、西北內(nèi)陸干旱區(qū)等[4]。作為我國重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地的黃河三角洲，地勢平坦，具備農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)越條件，但由于地理位置和氣候等原因，鹽堿土分布非常廣泛，面積約占土地總面積的50%[5]。鹽堿脅迫不是簡單的鹽脅迫與堿脅迫疊加，而是有一定的協(xié)同效應(yīng)，對植物的危害更為復(fù)雜和嚴重[6]。鹽堿脅迫對植物的傷害是一個復(fù)雜的生理生化過程，主要包括滲透脅迫、離子毒害、高pH傷害和活性氧脅迫等[7]。多年來，人們從土壤改良、栽培技術(shù)、培育耐鹽堿品種等方面對提高鹽堿地利用率和植物耐鹽堿性進行了大量研究[8-10]，而果樹耐鹽堿研究起步較晚。近年來，鹽堿脅迫響應(yīng)機理和選育耐鹽堿砧木已經(jīng)成為果樹耐鹽堿研究的熱點。

蘋果(Malus×domesticaBorkh.)是世界產(chǎn)量和消費量最大的4種水果之一[11]，2018年全球產(chǎn)量約為8 600萬t，其中我國的蘋果產(chǎn)量最高，約為 3 900萬t[12]，但土壤鹽堿化嚴重制約著我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。優(yōu)良的砧木能夠促進果樹生長，提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。因此，研究砧木對鹽堿脅迫響應(yīng)和耐受的分子機制對蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[14]。一直以來，人們對植物耐鹽堿機理的研究大多集中在鹽脅迫或堿脅迫方面，而對鹽堿脅迫的研究較少。此外，報道側(cè)重于對草本植物的影響，對蘋果砧木的研究較少[15]。平邑甜茶(MalushupehensisRehd.)是我國廣泛使用的蘋果砧木之一，具有無融合生殖特性[16]，非常適合于分子研究。本研究利用RNA-seq技術(shù)分析了鹽堿脅迫下平邑甜茶幼苗的轉(zhuǎn)錄本，獲得了大量差異表達基因，通過基因表達模式聚類分析和功能注釋，分析了平邑甜茶在鹽堿脅迫過程中顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，及其響應(yīng)鹽堿脅迫的分子機制，為今后蘋果砧木抗鹽堿分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在濱州學院黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點實驗室苗圃進行。種子和細沙分別用0.2% KMnO4浸泡30 min，再用自來水沖洗干凈。種子與細沙混勻后在4 ℃溫度下層積至露白。種子播種在塑料盆基質(zhì)(沙子、蛭石和土壤的體積比為3 ∶2 ∶1)中。幼苗在室外自然光和溫度條件下生長，使用1/2霍格蘭營養(yǎng)液(pH值=6.8±0.2)澆灌。

1.2 鹽堿脅迫處理

幼苗長到6～8張真葉時被分為處理組和對照組。處理組幼苗用含有200 mmol/L混合鹽(NaCl、Na2SO4、NaHCO3摩爾比為2 ∶1 ∶1，pH值=8)的 1/2 霍格蘭溶液處理；對照組用1/2霍格蘭溶液澆灌。分別在處理0、1、3、6 d采集處理組和對照組的新根和葉片(新根樣品編號：R000、R001、R003、R006；葉片樣品編號：L000、L001、L003、L006)。樣品用液氮處理后儲存在-80 ℃冰箱。

1.3 RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序與分析

采用Trizol法提取樣品總RNA。RNA質(zhì)量用NanoDrop One超微量紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)和Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies公司，美國)測定。mRNA用帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中富集，通過打斷buffer得到mRNA短片段，用隨機引物合成cDNA第1條鏈，接著形成雙鏈DNA，然后通過熱變性使產(chǎn)物形成單鏈，最后環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫。采用BGISEQ-500平臺(華大基因，深圳，中國)進行測序。

原始數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)過濾低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的片段得到純凈數(shù)據(jù)(clean data)。純凈數(shù)據(jù)與參考基因組序列(Malus×domesticaGDDH13 Whole Genome v1.，https：//www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_GDDH13_v1.1)[17-18]，并使用RSEM(RNA-Seq by expectation maximization)計算每個樣本的基因表達水平[19]，以FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)計算基因表達量。使用軟件Mfuzz對基因進行時間序列分析[20]。各樣品間的Pearson’s相關(guān)系數(shù)通過R軟件的cor函數(shù)計算。

1.4 基因表達水平分析及功能注釋

差異倍數(shù)(fold change)≥2或≤-2并且Q值(矯正P-value)≤0.001的基因被定義為差異表達基因[21]。利用基因本體論(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)，對差異表達基因進行富集分析，Q值≤0.05為顯著富集。利用NCBI Nr數(shù)據(jù)庫blast功能檢索差異表達基因的同源蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

本研究23 個樣品，每個樣品平均產(chǎn)出6.48 Gb數(shù)據(jù)，43.82×106個原始數(shù)據(jù)；樣品產(chǎn)生的純凈數(shù)據(jù)為42.71×106～43.44×106個。各樣品所得數(shù)據(jù)與基因組的平均比對率為 80.01%，與基因的平均比對率為76.54%；共41 008個基因被檢測到表達，其中38 465 個為已知基因，2 543個為預(yù)測的新基因。通過計算樣品之間所有基因表達量的Pearson’s相關(guān)系數(shù)(圖1)，發(fā)現(xiàn)每個樣品的各個生物重復(fù)之間，只有L001_1和L001_2之間的相關(guān)系數(shù)小于0.8，表明其余生物學重復(fù)樣品之間的相關(guān)性較好。

2.2 基因表達模式聚類分析

根據(jù)基因的表達量信息，表達模式一致的基因被聚到同一個基因簇中，根和葉中的基因分別聚類成12個基因簇(圖2)。其中，根中基因簇1、10以及葉中基因簇8、10表達上調(diào)；根中基因簇7、9、11以及葉中基因簇4、7表達下調(diào)。

2.3 基因功能注釋

對根中基因簇1、7、9、10、11以及葉中基因簇4、7、8、10中的基因進行了GO和KEGG 富集分析。結(jié)果顯示，GO富集分析包含生物過程、細胞組分和分子功能3類，根和葉中基因富集情況基本一致：生物過程中的細胞過程和代謝過程富集數(shù)量最多，細胞組分中的膜、膜部分、細胞和細胞器富集數(shù)量最多，分子功能中的結(jié)合和催化活性富集數(shù)量最多(圖3)。KEGG富集分析顯示根中基因簇1、7、9、10、11顯著富集的途徑分別為2、3、2、17、2個(表1)；葉中基因簇4、7、8、10顯著富集的途徑分別為5、4、4、25個(表2)。

利用NCBI Nr數(shù)據(jù)庫blast功能檢索了上述9 個基因簇的基因的同源蛋白，并將根和葉中表達變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)且表達量高的前10個基因分別列于表3、表4，根中基因簇11中只有3個基因，至少有一個樣品的FPKM≥1。結(jié)果表明，這些基因編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)、查爾酮合成酶、查爾酮-黃酮異構(gòu)酶、 熱休克蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細胞色素P450蛋白等。

3 結(jié)論與討論

本研究利用BGISEQ-500平臺對鹽堿脅迫不同時間的平邑甜茶根和葉進行了轉(zhuǎn)錄組測序，共有41 008個基因被檢測到表達，其中已知的基因有 38 465 個，預(yù)測的新基因有2 543 個?；虮磉_聚類分析顯示，根和葉中的基因分別聚類成12 個基因簇，其中，根中基因簇1、10和葉中基因簇8、10基因的表達被上調(diào)；根中基因簇7、9、11以及葉中基因簇4、7基因的表達被下調(diào)。表明這些基因可能在平邑甜茶受鹽堿脅迫過程中持續(xù)起作用。為了解這些基因的功能，對它們進行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，分子功能中的結(jié)合和催化活性富集基因的數(shù)量最多，此外，細胞組分中的膜、膜部分、細胞和細胞器以及生物過程中的細胞過程和代謝過程富集基因的數(shù)量也較多。這與葡萄和白刺在鹽脅迫后富集基因數(shù)量最多的是結(jié)合和催化活性的研究結(jié)果[22-23]一致。這些結(jié)果表明結(jié)合和催化活性是植物對鹽堿脅迫的主要響應(yīng)過程；膜、膜部分、細胞、細胞器、細胞過程和代謝過程同樣也在植物響應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮重要作用。KEGG富集分析顯示，根和葉中富集基因較多的途徑有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工、碳代謝、氨基酸的生物合成、核糖體、RNA轉(zhuǎn)運、植物激素信號轉(zhuǎn)導等。在受到鹽、堿脅迫時，高粱和榆葉梅的碳代謝途徑富集的基因數(shù)量較多[24-25]，表明植物可能需要大量能量來應(yīng)對鹽、堿脅迫，并且脅迫可能通過改變植物碳代謝相關(guān)基因的表達來影響植物生長[25]。

表1 根中基因的KEGG 途徑富集分析

表2 葉中基因的KEGG 途徑富集分析

鹽脅迫能引起果樹葉片凈光合速率下降[26]。葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)能夠促進光合作用正常進行，平邑甜茶葉片中葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)編碼基因(MD09G1292900、MD17G1281900)的表達量在受到鹽堿脅迫后顯著降低。另外，活性氧還會在植物體內(nèi)大量積累，為清除這些活性氧，植物會啟動如過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶類保護體系和類黃酮(黃酮類化合物)、谷胱甘肽、抗壞血酸等非酶類保護體系[1]。平邑甜茶根中過氧化物酶編碼基因MD11G1061100的表達被顯著上調(diào)，而MD13G1053000的表達被顯著下調(diào)。查爾酮合成酶是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[27]，查爾酮-黃酮異構(gòu)酶也在類黃酮合成途徑中起重要作用[28]，類黃酮在抗氧化方面具有重要作用。本研究中平邑甜茶葉片中查爾酮合成酶編碼基因(MD04G1003300、MD04G1003400)和查爾酮-黃酮異構(gòu)酶編碼基因(MD01G1167300、MD07G1233400)的表達均顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明平邑甜茶在受到鹽堿脅迫后光合作用減弱，并通過酶類和非酶類保護體系清除體內(nèi)的活性氧。

熱休克蛋白對植物熱應(yīng)激損傷的恢復(fù)及提高植物耐熱性具有重要作用[29]，它能穩(wěn)定染色質(zhì)、蛋白質(zhì)和膜，并通過再折疊促進蛋白質(zhì)在脅迫期間或脅迫后的修復(fù)[30]。熱休克蛋白的表達受溫度或鹽度等環(huán)境條件的影響[31]。NaHCO3脅迫條件下，檉柳根中熱休克蛋白編碼基因的表達有的被上調(diào)，有的被下調(diào)[30]。在本研究中，5個熱休克蛋白編碼基因(MD01G1126500、MD01G1144400、MD01G1208700、MD07G1196500、MD13G1108500)的表達被顯著下調(diào)。熱休克響應(yīng)由2個重要成員——熱休克蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子組成。熱激轉(zhuǎn)錄因子在熱脅迫防御響應(yīng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[32]，通過識別高度保守的熱休克元件并與‘nGAAnnTCCn’基序特異結(jié)合調(diào)節(jié)熱休克蛋白編碼基因的表達，來控制植物對不同環(huán)境脅迫的反應(yīng)[33-34]。平邑甜茶一個熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(MD13G1199700)的表達被下調(diào)，表明熱休克響應(yīng)可能在平邑甜茶響應(yīng)鹽堿脅迫過程中也發(fā)揮重要作用。

表3 根中基因簇中表達量高且表達變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)的部分基因

表4 葉中基因簇中表達量高且表達變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)的部分基因

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物對鹽堿物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[35-37]。除熱激轉(zhuǎn)錄因子，本研究還發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子(MD08G1092000)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子(MD04G1167700)、鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白(MD01G1154000、MD07G1222900)、鋅指蛋白ZAT10(MD01G1041900、MD08G1086500)、鋅指蛋白(MD15G1037200)的表達被顯著下調(diào)；ORG2轉(zhuǎn)錄因子(MD14G1086500)、COL結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子(MD17G1243400)的表達被顯著上調(diào)。MYB家族是植物體重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[38]。在干旱和鹽脅迫下，向日葵55 個MYB基因中有9 個的表達被下調(diào)，4 個被上調(diào)[39]。超表達AtMYB111的擬南芥耐鹽性強于野生型，而AtMYB111缺失顯著降低了擬南芥耐鹽性[40]。鋅指蛋白是一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它由CCCH、C2H2、C2HC、C2HC5、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8(C和H分別代表半胱氨酸和組氨酸)9大類組成[41]，在植物耐非生物脅迫方面具有重要作用[42]。本研究中的6 個鋅指蛋白的編碼基因(MD01G1154000和MD07G1222900屬于CCCH類，MD01G1041900、MD08G1086500、MD04G1167700 和MD15G1037200屬于C2H2類)的表達均被顯著下調(diào)，可以推測這些轉(zhuǎn)錄因子與平邑甜茶抗鹽堿調(diào)控密切相關(guān)。

細胞色素P450是一個酶蛋白大家族[43]。它們參與細胞分裂素、生長素、赤霉素等植物內(nèi)源激素的生物合成以及許多次生代謝[44-45]。Khanom等研究發(fā)現(xiàn)，人參中PgCYP736A12在NaCl處理后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，該基因參與除草劑的代謝[46]。本研究中1 個細胞色素P450編碼基因MD11G1220400的表達受鹽堿脅迫誘導而持續(xù)升高，表明細胞色素P450可能在平邑甜茶鹽堿響應(yīng)的機制中發(fā)揮重要作用。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和TMK1受體蛋白激酶等的表達也受鹽堿脅迫的誘導，說明這幾類蛋白激酶在平邑甜茶鹽堿脅迫響應(yīng)中也可能發(fā)揮一定作用。研究中還發(fā)現(xiàn)一些未知蛋白可能與鹽堿脅迫相關(guān)，如MD14G1226200、MD02G1030600、MD15G1189900 和MD08G1127700等，它們的具體功能有待進一步驗證。