李永峰， 王克華， 竇套存， 胡玉萍， 郭 軍， 王星果， 馬 猛， 曲 亮

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125)

飼料成本是蛋雞飼養(yǎng)成本主要組成部分，通過提高飼料效率可有效降低飼養(yǎng)成本，優(yōu)化飼料配方是提高飼料效率的重要手段。然而，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因選擇成為一種更有效的方法[1]。腸道發(fā)育是家禽飼料效率的重要影響因素之一，與消化酶的活性和營養(yǎng)吸收能力息息相關(guān)[2]。腸道質(zhì)量是反映腸道發(fā)育的重要指標(biāo)。目前，關(guān)于雞小腸質(zhì)量遺傳背景的研究很少，有必要對其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。GWAS通過對全基因組中的序列變異、表型和系譜信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而篩選出目標(biāo)性狀的調(diào)控基因或元件[3]。與傳統(tǒng)QTL定位作圖方法相比，GWAS檢測變異的效果更好，定位的基因組區(qū)域更窄[4]。在雞的形態(tài)特征、生產(chǎn)性狀、抗病等方面已有許多GWAS研究成果[3]，但與雞小腸質(zhì)量有關(guān)的GWAS研究鮮有報(bào)道。本研究選取F2代資源群體母雞1 512羽，采用600K雞SNP芯片進(jìn)行基因型檢測和GWAS分析，以期為蛋雞小腸質(zhì)量性狀的遺傳機(jī)制解析提供參考，為分子育種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 資源群體構(gòu)建

由白來航(WL)純系和東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(DX)純系雜交生產(chǎn)F2代資源群體，由圖1可知，最終獲得F2代個(gè)體母雞1 893羽，從中選擇1 534羽用于SNP基因型檢測。試驗(yàn)時(shí)間為2012—2014年，試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省家禽科學(xué)研究所揚(yáng)州翔龍禽業(yè)有限公司。

1.2 表型測定

屠宰72周齡F2代雞，收集十二指腸、空腸和回腸，擠壓出內(nèi)容物后稱質(zhì)量記錄。使用SAS進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)轉(zhuǎn)換后用于GWAS和遺傳估計(jì)等下游分析。

1.3 基因分型、質(zhì)量控制

雞翅靜脈采血收集F2代母雞血液，血液DNA使用苯酚/氯仿萃取法抽提，選用600K Affymetrix Axiom雞高密度基因芯片進(jìn)行基因型檢測，通過Affymetrix工具v1.16.0軟件執(zhí)行質(zhì)量控制(QC)，保留QC≥0.82樣品，獲得有效樣本1 512個(gè)，有效SNP 532 299個(gè)。本統(tǒng)計(jì)方法對表型和性染色體基因型的關(guān)聯(lián)檢測低于常染色體，因此刪除性染色體上所有SNP。使用PLINK v1.90軟件包做進(jìn)一步質(zhì)量控制[5]，剔除次等位基因頻率<0.05、偏離哈迪溫伯格檢驗(yàn)(P<10-6)的SNP?；蛐吞畛浞治鲇葿EAGLE v4.0[6]程序執(zhí)行，保留質(zhì)量分?jǐn)?shù)(R2>0.5)的SNP，最終獲得1 512羽個(gè)體和435 867個(gè)SNP。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

為消除虛假關(guān)聯(lián)，首先使用PLINK軟件包進(jìn)行主成分分析。利用simpleM[7]法計(jì)算全基因組顯著性和潛在性關(guān)聯(lián)的閾值。有效獨(dú)立測試值為 59 308，因此全基因組顯著性P值為8.43×10-7(0.05/59 308)，潛在性P值為1.69×10-5(1.00/59 308)。使用GEMMA v0.94軟件[8]中的單變量混合模型對小腸質(zhì)量性狀進(jìn)行GWAS，模型公式如下：

y=wα+xβ+μ+ε；

其中：y是n個(gè)個(gè)體的n×1表型值向量；w為固定效應(yīng)，是n×c協(xié)變量矩陣，包括列向量1；α是c×1相應(yīng)系數(shù)向量，包括截距；x是測試位點(diǎn)的n×1標(biāo)記基因型向量；β表示每個(gè)標(biāo)記中次等位基因的效應(yīng)，是標(biāo)記的效應(yīng)大小；μ是n×1隨機(jī)效應(yīng)向量，協(xié)方差結(jié)構(gòu)為μ-N(0，KVg)，其中K表示n×n遺傳相關(guān)矩陣，來源于SNP標(biāo)記，Vg是多基因加性方差；ε是ε～N(0，IVe)的n×1隨機(jī)殘差的向量，I是n×n單位矩陣，Ve是殘差方差分量。

使用R軟件GAP包繪制曼哈頓和quantile-quantile(QQ)圖，GenABEL包中的estlambda函數(shù)計(jì)算基因組膨脹因素λ(表示假陽性信號程度)[9]。

1.5 遺傳力估計(jì)及對表型方差貢獻(xiàn)率

使用REML法估計(jì)遺傳力，由GCTA v1.24程序執(zhí)行[10]。使用二元混合模型估計(jì)各部分腸質(zhì)量遺傳和表型相關(guān)[11]。估計(jì)全基因組顯著SNP、表型方差貢獻(xiàn)的混合線性模型如下：

其中，y是表型向量；x是解釋表型固定效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣；b是固定效應(yīng)向量；zj是基因型協(xié)變量SNPj(AA=-10，AB=0，BB=+10)；αj是SNPj的等位基因替代效應(yīng)；δj是參數(shù)，表示SNPj是否包含在馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)鏈；ε是與分析相關(guān)的誤差。

1.6 基因鑒定

使用Biomart工具(基于Ensembl支持的Galgal4組件)和變異效應(yīng)預(yù)測軟件VEP鑒定顯著位點(diǎn)的候選基因[12]，并檢測給定基因組區(qū)域中的基因[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型和遺傳參數(shù)

表1為十二指腸質(zhì)量(DW)、空腸質(zhì)量(JW)、回腸質(zhì)量(IW)描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果。共測量 1 508 羽母雞，獲得十二指腸1 435個(gè)、空腸1 436個(gè)、回腸 1 434 個(gè)有效數(shù)據(jù)。3個(gè)性狀的變異系數(shù)均較大，這可能是由于F2代資源群體的個(gè)體差異較大。

表1 F2代雞小腸質(zhì)量的描述性統(tǒng)計(jì)

通過合格的GWAS標(biāo)記對計(jì)算DW、JW、IW的加性遺傳方差，并統(tǒng)計(jì)遺傳參數(shù)。由表2可知，單變量GCTA分析顯示，3種腸道質(zhì)量性狀遺傳力在中等水平，DW的遺傳力估計(jì)值最高，為0.32。雙變量GCTA分析表明，3種腸道質(zhì)量性狀表現(xiàn)出較高的遺傳相關(guān)，JW與IW的遺傳相關(guān)最高，為0.88。表型分析表明，3種小腸質(zhì)量也具有中等程度表型相關(guān)。

表2 小腸質(zhì)量遺傳參數(shù)

2.2 候選位點(diǎn)GWAS鑒定

對3種小腸質(zhì)量分別進(jìn)行單變量全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果由表3、圖2可知，分別有185、201、36個(gè)全基因組顯著SNP位點(diǎn)與DW、JW、IW關(guān)聯(lián)(共422個(gè))。幾乎所有的顯著位點(diǎn)均位于1號染色體的166.6～173.2 Mb基因組區(qū)域，僅有1個(gè)顯著SNP位點(diǎn)位于4號染色體的49.9 Mb基因組區(qū)域。由圖2可知，共有28個(gè)顯著SNP位點(diǎn)與3種小腸質(zhì)量性狀均顯著相關(guān)。根據(jù)所有影響DW、JW、IW的SNP的P值制作曼哈頓圖和QQ圖(圖3)。

表3 顯著SNP位點(diǎn)數(shù)量和分布

2.3 顯著位點(diǎn)的基因注釋

基因內(nèi)部的SNP比基因間區(qū)域的更重要。由表4可知，通過VEP和Biomart對3種小腸質(zhì)量性狀均顯著的28個(gè)SNP周圍區(qū)域進(jìn)行掃描，鑒定與3種小腸質(zhì)量相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)SNP位于4個(gè)基因的內(nèi)含子區(qū)。rs313669574和rs313152047對應(yīng)基因FOXO1，rs315029039對應(yīng)基因CKAP2，rs313765223對應(yīng)基因CAB39L，rs312737959和rs13972990對應(yīng)基因MRPS31。將這6個(gè)SNP位點(diǎn)和4個(gè)基因作為候選位點(diǎn)和基因。

2.4 估計(jì)表型方差貢獻(xiàn)率(CPV)

對上述6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行CPV計(jì)算，由表4可知，位點(diǎn)rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990可分別解釋小腸質(zhì)量表型方差的2.92%～3.26%、2.84%～4.80%、3.23%～3.71%、3.29%～5.33%、3.26%～4.99% 和3.29%～4.85%。

3 討論

腸道作為重要的消化器官，其發(fā)育對動物的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能有重要影響，有必要對腸道質(zhì)量基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行。GWAS是研究動物遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的有效手段，廣泛應(yīng)用于多種畜禽，如豬[14-15]、牛[16-17]和家禽[18-19]。因此，本研究對1 512羽F2代蛋雞資源群體小腸質(zhì)量進(jìn)行GWAS分析，擴(kuò)大性狀差異化水平，提高差異性狀QTL識別能力，并使用高密度SNP芯片覆蓋雞所有的染色體，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，小腸質(zhì)量的變異系數(shù)很大， 提示個(gè)體間性狀差異化水平很高。遺傳評估的結(jié)果表明，DW、JW、IW均具有中等遺傳力。性狀相關(guān)的分析結(jié)果表明，3個(gè)小腸質(zhì)量性狀具有較高的遺傳相關(guān)性，但表型相關(guān)均處于中等水平，說明環(huán)境因素對小腸質(zhì)量性狀的影響較大。這與Li等關(guān)于小腸長度的研究結(jié)果[20]相似，二者的遺傳特征相似。

GWAS的結(jié)果表明，DW、JW、IW的422個(gè)顯著SNP位點(diǎn)中，有421個(gè)位于1號染色體的166.6～173.2 Mb區(qū)域，表明3個(gè)小腸質(zhì)量的遺傳控制高度集中。這與我們在小腸長度的研究結(jié)果相似，顯著SNP位點(diǎn)集中在1號染色體的170 Mb區(qū)域[20]，表明腸道發(fā)育的遺傳控制主要集中在1號染色體的170 Mb附近區(qū)域。

通過對DW、JW、IW均顯著的28個(gè)SNP進(jìn)行分析研究，有6個(gè)SNP(rs313669574、rs313152047、rs315029039、rs313765223、rs312737959和rs13972990)和對應(yīng)的4個(gè)基因(FOXO1、CKAP2、CAB39L和MRPS31)被列為最重要的SNP位點(diǎn)和基因，因?yàn)檫@6個(gè)SNP位于相應(yīng)基因的內(nèi)含子區(qū)。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子FOXO1(forkhead box O1)可能在肌源性生長和分化中起作用，是調(diào)節(jié)胰島素靶組織中葡萄糖代謝和胰島素反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21-22]。研究表明口服胰島素可刺激IUGR仔豬小腸絨毛的生長和黏膜功能的成熟[23-24]，因此推測它在小腸發(fā)育中可能通過調(diào)節(jié)胰島素起作用。CKAP2(cytoskeleton associated protein 2)是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白2，參與細(xì)胞的有絲分裂過程[25]。研究表明，CKAP2在視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞[26]和肝癌細(xì)胞[27]的增殖、遷移中發(fā)揮作用，并與卵泡發(fā)育和選擇關(guān)系密切[28]，推測其可能與多器官的發(fā)育有關(guān)。CAB39L(calcium binding protein 39 like)作為MO25家族成員，編碼鈣結(jié)合蛋白39樣。研究表明CAB39L能夠通過AMPK途徑調(diào)節(jié)食物的攝入[29-30]，且雞體內(nèi)也存在與哺乳動物相似的AMPK途徑[31]。腸道發(fā)育也與動物的采食量有關(guān)，但其與CAB39L的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。MRPS31(mitochondrial ribosomal protein S31)是線粒體核糖體蛋白S31，參與線粒體中蛋白質(zhì)的合成，在各種生命活動中都起重要作用。綜上所述，這4個(gè)基因可能與小腸重量高度相關(guān)，而其對應(yīng)的6個(gè)SNP的CPV均較高，進(jìn)一步說明它們可能是影響雞小腸質(zhì)量的重要候選基因。

表4 小腸質(zhì)量性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

4 結(jié)論

通過GWAS共鑒定出28個(gè)與DW、JW、IW均顯著相關(guān)的SNP，全部集中在1號染色體的166.6～173.2 Mb區(qū)域，其中6個(gè)SNP位于相應(yīng)4個(gè)基因的內(nèi)含子區(qū)，這些位點(diǎn)和基因可能是影響小腸質(zhì)量的重要SNP位點(diǎn)和基因。