田 賜， 馬樹杰， 張利輝， 董金皋

(華北作物改良與調控國家重點實驗室/河北農業(yè)大學植物保護學院，河北保定 071001)

玉米(Zeamays)是全球產量最大、用途最廣的作物，然而田間雜草的存在會引起玉米田產量降低，經濟效益下降[1-3]?；瘜W除草劑雖快速防除了雜草，解決了其對玉米田間的危害，但隨著單一品種的大量使用，一系列的問題也隨之產生，例如抗性提高，水質、土壤的污染，人畜中毒等[4-6]。在農業(yè)生產中，通常利用除草劑與增效助劑復配和研發(fā)天然源除草劑等措施來減少化學除草劑在田間產生的負面作用。其中，如何有效地將除草劑減量使用并達到增效作用是實現(xiàn)玉米田雜草綠色防控和安全生產的主要研究方向[7-8]。

微生物農藥因對人類和環(huán)境安全、不易產生抗性以及可改造性強等優(yōu)點，在有害生物防治中具有良好的發(fā)展?jié)摿9]。微生物農藥雖有眾多優(yōu)點，但也存在防治效果慢、防治范圍窄、穩(wěn)定性較差等缺點[10-11]。為了擴大微生物的殺草譜，可以將2種或2種以上具有抑制雜草活性的菌株混合在一起，進行復合菌劑的制作，針對性解決微生物農藥防治范圍窄、對環(huán)境的適應性差等問題。研究發(fā)現(xiàn)，塔賓曲霉屬菌株Z-5和黑曲霉屬菌株Z-6復配后，對馬唐、苘麻、鵝頭稗和馬齒莧達到80%的防除效果[12]。還可以將微生物除草劑與化學除草劑進行復配研究，如不同濃度精吡氟禾草靈和阿特拉津與菌株分生孢子混配的防效明顯高于單獨使用時對馬唐雜草的防除效果[13]。

黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)屬于腸桿菌科，具有很高的生物活性，其活體菌株對鱗翅目害蟲甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和半翅目害蟲褐飛虱(NilaparvatalugensStal)具有一定毒力作用，并已被列為黃脛小車蝗(Oedaleusinfernalis)的生防菌，黃脛小車蝗感染黏質沙雷氏菌4 d后的死亡率達87%[14-16]。黏質沙雷氏菌還具有較高的除草活性，其粗提物對馬唐和萊茵衣藻具有較強的抑制活性，活體菌劑與化學除草劑復配對馬唐的抑制率達63.12%[17-18]；此外，黏質沙雷氏菌代謝產物靈菌紅素可以抑制多種細菌及真菌，如銅綠假單胞菌、小雙胞腔菌等，有望被開發(fā)作為新型殺菌劑[19]。綜合多方面農用活性來看，黏質沙雷氏菌具有良好的應用前景。本研究利用黏質沙雷氏菌Ha1菌株與死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)07-1菌株進行復合菌劑制作，按照國家標準規(guī)定對復合菌劑檢測后將其與玉米田化學除草劑減量復配使用，結合2種菌株復合發(fā)酵液以及與化學除草劑復配的田間試驗效果，篩選出最優(yōu)的復配措施，以期為玉米田除草劑的減量增產提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試雜草 主要試驗雜草有反枝莧(Amaranthusretroflexus)、稗(Echinochloacrusgalli)。

1.1.2 供試菌株 主要菌株有黏質沙雷氏菌(S.marcescens)Ha1菌株、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)07-1菌株。

1.1.3 供試藥劑 主要試劑有蛋白胨、瓊脂、酵母粉、蔗糖(北京索萊寶科技有限公司)、高嶺土、粗面粉、50%莠去津懸浮劑(山東濱農科技有限公司)、10%煙嘧磺隆可分散油懸浮劑(山東奧坤作物科學股份有限公司)、40%乙·莠懸乳劑(乙草胺21.1%，莠去津18.9%)(濟南天邦化工有限公司)、26%煙·莠可分散油懸浮劑(煙嘧磺隆4%，莠去津22%)(德州祥龍生化有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 Ha1菌株復合菌劑制作 Ha1菌株和07-1菌株最適稀釋梯度的篩選(以Ha1菌株為例)：Ha1菌株在搖床(20 ℃，200 r/min)培養(yǎng)24 h后取出，吸取100 μL菌懸液加入到900 μL無菌水中，搖勻，即為10-1菌懸液；從10-1菌懸液中吸取100 μL加入到900 μL的無菌水中，為10-2菌懸液，以此類推，直至稀釋到10-10。從10-6、10-7、10-8、10-9、10-10菌懸液中分別吸取100 μL菌懸液進行涂板，培養(yǎng)48 h后查看菌株生長情況，能數(shù)出單菌落時的稀釋倍數(shù)為最適倍數(shù)，每個處理重復3次。篩選結果顯示，Ha1菌株最佳稀釋梯度為10-8，07-1菌株最佳稀釋梯度為10-7。

選用高嶺土和粗面粉為顆粒劑的載體，兩者的體積比為2 ∶1，稀釋好的Ha1菌株與07-1菌株加入適量的高嶺土與粗面粉混合物，于造粒機中造粒，顆粒置于通風良好處風干，備用。

配制好的Ha1菌株與07-1菌株復合顆粒劑根據GB 20287—2006《農用微生物菌劑》測定顆粒劑有效活菌數(shù)及雜菌數(shù)、水分含量和pH值[18，20]。

1.2.2 Ha1菌株復合菌劑除草活性及安全性測定 苗前處理：將蛭石 ∶營養(yǎng)土 ∶草木灰按體積比2 ∶1 ∶1混合，裝入長寬高為7 cm×7 cm×10 cm的塑料花盆，將其放入45 cm×30 cm的周轉箱中自然吸水，塑料花盆中土壤完全濕潤后，挑選飽滿露白一致的雜草種子均勻播種于花盆中，表層覆蓋 0.3～0.5 cm的營養(yǎng)介質，然后分別撒入7.74×109、15.48×109、3.09×1010、6.19×1010、12.38×1010CFU/g的Ha1菌株與07-1菌株復合菌劑，同時設置陽性對照莠去津(田間推薦劑量為 0.45 mL/m2)和空白對照，每個處理4次重復。置溫室(溫度28 ℃，濕度40%，光照12 h)進行培養(yǎng)，7 d 后測定雜草地上部鮮質量，計算抑制率。鮮質量抑制率=(對照組雜草鮮質量-處理組殘存雜草鮮質量)/對照組雜草鮮質量×100%。

苗后處理：待雜草長至3～4葉期，將顆粒劑均勻撒到土層表面，使用劑量及處理同苗前處理，設置陽性對照煙嘧磺隆(田間推薦劑量為 0.06 mL/m2)及空白對照，每個處理4次重復，7 d 后測定雜草地上部鮮質量，并計算抑制率。

Ha1菌株與07-1菌株顆粒劑對玉米的安全性測定：在每個塑料花盆中種植5棵露白的玉米種子，將Ha1菌株復合菌劑3.09×1010CFU/m2均勻撒在土壤表面，溫室(溫度28 ℃，濕度40%，光照12 h)生長7 d后測定玉米發(fā)芽生長情況；玉米在塑料花盆中長至3～5葉期時，進行Ha1菌株復合菌劑的撒施處理，設置清水為空白對照，每個處理4次重復，在溫室生長7 d后測定顆粒劑對玉米地上部生長的影響。

1.2.3 化學除草劑對Ha1菌株及07-1菌株生長的影響 測定除草劑40%乙·莠懸乳劑和26%煙·莠可分散油懸浮劑與Ha1菌株和07-1菌株的相容性。將40%乙·莠懸乳劑和26%煙·莠可分散油懸浮劑分別加入到150 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，分別配制成0.6 mL/m2和0.15 mL/m2(推薦劑量)，2種菌株的接入量均為100 μL，具體處理如表1。

表1 除草劑與菌株相容性試驗設計

按照表1配制好各處理后，將Ha1菌株的處理放入20 ℃搖床，07-1菌株放入37 ℃搖床，在48、72、96、120、144 h將菌懸液取出，各處理稀釋至10-8、10-9、10-10涂板，每個處理3次重復，24 h后觀察單菌落，查看菌株繁殖狀況。

1.2.4 Ha1菌株復合菌劑與化學除草劑復配室內除草活性測定 在明確除草劑對菌株生長無抑制作用后，將40%乙·莠懸乳劑和26%煙·莠可分散油懸浮劑分別進行全量、減量30%與Ha1菌株復合菌劑1.95×1010CFU/m2復配以及空白對照試驗，每個處理4次重復。

1.2.5 Ha1菌株復合菌劑與化學除草劑復配后對玉米的安全性 40%乙·莠懸乳劑田間推薦劑量0.60 mL/m2、40%乙·莠懸乳劑(減量30%) 0.42 mL/m2+Ha1菌株復合菌劑1.95×1010CFU/m2、26%煙·莠0.15 mL/m2、26%煙·莠(減量30%)0.10 mL/m2+Ha1菌株復合菌劑 1.95×1010CFU/m2及清水對照，每個處理4次重復，7 d后調查玉米地上部鮮質量，計算抑制率，測定方法與公式同“1.2.2”節(jié)。

1.2.6 田間小區(qū)試驗設計 2021年4—11月在河北省保定市徐水區(qū)高林營村進行田間試驗。根據GB/T 17980.41—2000《農藥田間藥效試驗準則》采用隨機區(qū)組設計；小區(qū)面積為27 m2，每個處理重復4次，玉米品種為鄭單958，噴藥量為30 L/667 m2，苗前在種植玉米后進行處理，苗后在玉米3～5葉期時處理，詳細試驗處理見表2、表3。

表2 Ha1菌株復合菌劑與苗前除草劑玉米田減量試驗設計

1.2.7 田間試驗調查 根據GB/T 17980.41—2000《農藥田間藥效試驗準則》進行田間雜草防效調查，分別在施藥后7、14、28 d取樣調查株數(shù)，14、28 d時調查雜草地上部鮮質量；采用棋盤式取樣法，每個小區(qū)取樣4個點(每個樣點0.25 m2)。防治測產時，每個小區(qū)取中部2行玉米，每行20株，調查穗行數(shù)、行粒數(shù)，計算穗粒數(shù)、小區(qū)有效穗數(shù)；根據公式計算乘以縮值系數(shù)0.85的產量：產量(kg/667 m2)=小區(qū)有效穗數(shù)(穗/667 m2)×穗粒數(shù)(粒/穗)×百粒質量(g)÷100×0.85。

表3 Ha1菌株復合菌劑與苗后除草劑玉米田減量試驗設計

1.3 數(shù)據處理及分析

利用Excel對試驗數(shù)據進行處理，SPSS 19.0軟件進行鄧肯氏新復極差(DMRT)法進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 Ha1菌株復合菌劑研究

由表4可知，Ha1菌株與07-1菌株的顆粒劑中有效活菌數(shù)為38.7×107CFU/g，雜菌率為3.1%，pH值為6.56，水分含量為4.2%，所測指標均處于國家標準規(guī)定范圍之內，符合復合菌劑制作標準。

表4 Ha1菌株復合菌劑生物特性測定

2.2 Ha1菌株復合菌劑室內除草活性研究

Ha1菌株復合菌劑的不同施藥劑量對苗前、苗后的稗和反枝莧地上部鮮質量試驗結果(表5)表明，在施用量為12.38×1010CFU/g時，顆粒劑對稗苗前、苗后的鮮質量抑制率分別為66.74%、75.00%；而在試驗過程中，由于反枝莧長勢較弱，需采取移栽的方法進行試驗，故對反枝莧僅進行了苗后處理，同施用量下反枝莧的鮮質量抑制率達66.05%。

表5 不同施藥劑量Ha1菌株復配顆粒劑對雜草苗前和苗后的室內抑制效果

2.3 化學除草劑對Ha1菌株及07-1菌株的影響

測定2種化學除草劑處理后144 h內對Ha1菌株與07-1菌株的生長影響，由圖1、圖2可知，化學除草劑26%乙·莠懸乳劑和40%煙·莠可分散油懸浮劑對2種菌株的生長均未產生抑制作用，調查結果表明，同一生長期2種菌株的活菌數(shù)均低于添加除草劑的處理，在144 h時，添加乙·莠的處理中，Ha1菌株和07-1菌株的活菌數(shù)都達到最高，分別為2.16×1012、1.63×1012CFU/mL，復配后2種菌株和除草劑的相容性良好，可以將2種化學除草劑與2種菌株復配進行田間除草試驗研究。

2.4 Ha1菌株復合菌劑與化學除草劑復配室內除草活性測定及對玉米安全性測定

Ha1菌株復合菌劑與2種化學除草劑推薦劑量復配后室內除草活性測定中，除了空白對照外，所有處理組雜草全部死亡，抑制率達100%。同樣的處理對玉米進行安全性測定后，結果如表6所示，4種處理對玉米的鮮質量并未產生抑制效果，抑制率均在0以下，可以應用到大田試驗。

表6 化學除草劑與Ha1菌株復合顆粒劑復配對玉米安全性測定結果

2.5 Ha1菌株復合菌劑與化學除草劑復配對田間雜草防效

田間試驗結果表明，苗前處理中40%乙·莠懸乳劑與Ha1菌株復合菌劑復配處理對雜草28 d的株數(shù)和鮮質量防效分別為80.65%、98.02%，玉米產量為440.71 kg/667 m2，與對照區(qū)玉米產量相比增產6.70%。苗后田間處理中26%煙·莠可分散油懸浮劑與Ha1復合顆粒劑復配的處理對田間雜草14 d的鮮質量防效為98.62%，28 d的株數(shù)與鮮質量防效分別是85.16%和99.59%，產量為 486.93 kg/667 m2，較對照區(qū)的玉米產量提高了17.93%(表7)。

3 結論與討論

雜草與作物競爭水分、光照和養(yǎng)分，是造成農田產量損失的主要生物因素[21-24]?；瘜W除草劑的不規(guī)范使用是導致雜草抗性、藥害等問題產生的主要原因，怎樣有效解決化學除草劑帶來的負面問題備受大眾關注，開發(fā)新型天然除草劑是當下主要任務，通過添加增效助劑來實現(xiàn)化學除草劑減量增效是農田常用的農業(yè)生產措施[25-27]。據研究，添加紅太陽A8助劑后的異丙隆藥液防除菵草時90%有效劑量(ED90)降低626.3 g/hm2；除草劑50%丙炔氟草胺可濕性粉劑和33%二甲戊靈乳油用量減量20%后添加激健、安融樂、增效王等3種噴霧助劑，發(fā)現(xiàn)棉田雜草防除效果與常規(guī)用量相當，且對棉花生長發(fā)育安全[28-29]。

表7 Ha1菌株復合顆粒劑與除草劑減量復配對田間雜草防效

微生物復合菌劑具有比單菌株更能夠長期發(fā)揮作用、效果穩(wěn)定并增加作物產量等諸多優(yōu)勢[30-31]。在楊杰等的研究中，利用棉花內生真菌進行了復合菌劑的制作，對棉花黃萎病進行防效調查，結果表明6月中旬前后將該配方以30 kg/hm2用量分2次等量隨水滴施，對棉花黃萎病的防治效果較好，并有增產提質效果[32]；用2株無拮抗作用的放線菌菌株的復合菌劑研究對番茄青枯病的防治效果，發(fā)現(xiàn)復合發(fā)酵液的抑菌率明顯高于單一菌株，盆栽防效達82.03%，干質量增加76.58%，有望進行菌肥的開發(fā)利用[33]。

黏質沙雷氏菌在自然界中廣泛存在，在土壤、海洋和動植物中均可分離獲得，菌株除了具有抗炎、殺菌和殺蟲活性外，還表現(xiàn)出了一定的除草活性[34-35，19]。本研究制備的Ha1菌株與07-1菌株復合顆粒劑生物特性符合國家標準，且與玉米田常用化學除草劑復配后，均優(yōu)于復合菌劑對玉米田雜草的防效。據實驗室前期研究，黏質沙雷氏菌Ha1菌株制備的顆粒劑對玉米田雜草有較好的防效，可達76.82%[17，36]，本研究結果與之相符，均顯示了Ha1菌株較高的除草活性。化學除草劑的種類較多，不同除草劑與菌劑混用有不同的除草效果，而Ha1菌株復合菌劑與各類不同除草劑的復配效果，可以開展相關試驗對其進一步研究。