陳 璨， 余寧靜， 單新宇， 盧 杰， 張海萍， 司紅起， 馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，簡稱FHB)在我國乃至世界各地普遍發(fā)生，是溫暖濕潤和半濕潤麥區(qū)的重要病害之一。在大流行年份，赤霉病病穗率為50%～100%，產(chǎn)量損失超過80%，甚至絕收[1]。赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)侵染引起的真菌性病害，鐮刀菌侵染小麥后，不僅嚴(yán)重影響了小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量，其產(chǎn)生的各種真菌毒素，雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，簡稱NIV)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡稱DON)等難以降解，會使小麥籽粒及其加工制品受到污染，進(jìn)入食物鏈對人畜健康造成危害。Schroeder等首次將小麥赤霉病抗性分為抗侵染(TypeⅠ)和抗擴展(TypeⅡ)2類[2]；Mesterhazy等在此基礎(chǔ)上提出了3種新抗性類型，分別為抗毒素積累(TypeⅢ)、籽粒抗感染性(Type Ⅳ)和耐病性(TypeⅤ)[3]。TypeⅠ型體現(xiàn)小麥抵抗病原菌初侵染的能力，一般采用自然發(fā)病或孢子彌霧接種條件下的病穗率或病情指數(shù)(disease index，簡稱DI)表示；Type Ⅱ型指小麥抵御病原菌沿穗軸擴展的能力，一般在小麥揚花期采用人工單花滴注接種下的病小穗率為指標(biāo)；Type Ⅲ型抗性指小麥抑制毒素積累或降解真菌毒素的能力，一般用籽粒中毒素積累量進(jìn)行評估；Type Ⅳ型可以用感病籽粒的比例進(jìn)行衡量；Type Ⅴ型利用在一定發(fā)病程度下的小麥產(chǎn)量損失進(jìn)行評價[4]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，簡稱GWAS)是以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，簡稱LD)為基礎(chǔ)，以自然群體為研究對象，通過目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從而得到關(guān)聯(lián)位點的分析方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻等多種農(nóng)作物當(dāng)中[5]。國內(nèi)外研究者們對小麥赤霉病抗性展開了大量研究，目前已定位400多個數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，簡稱QTL)，分布在小麥的21條染色體上[6]。已發(fā)現(xiàn)的小麥赤霉病抗病基因有Fhb1～Fhb7[7]，其中位于3BS染色體上的Fhb1最早在我國小麥品種蘇麥3號中被發(fā)現(xiàn)，其在各種環(huán)境和遺傳背景下都較穩(wěn)定，現(xiàn)已在育種工作中得到廣泛應(yīng)用。Arruda等對273份美國冬小麥品種進(jìn)行GWAS分析，在4A、6A、7A、1D、4D、7D染色體上發(fā)現(xiàn)了與赤霉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)以及多個與Fhb1關(guān)聯(lián)的標(biāo)記[8]。Wang等通過對PNW和CIMMYT地區(qū)的170份春小麥材料進(jìn)行赤霉病綜合評價，鑒定出一些與蘇麥3號有相似抗性的優(yōu)質(zhì)品系，在1B、2B、4B、5A、5B、6A 染色體上關(guān)聯(lián)到了顯著SNP位點，其中位于5BS上的QTL可能是一個新的抗DON積累位點[9]。朱展望通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在自然群體中發(fā)現(xiàn)5個較為穩(wěn)定的抗赤霉病位點，可解釋5.0%～10.3%的表型變異率，在揚麥16/中麥895群體中檢測到7個穩(wěn)定的位點，并開發(fā)連鎖標(biāo)記[10]。

5種抗性類型遺傳和作用機制各不相同，它們協(xié)同作用可提高小麥對赤霉病的整體抗性[11]，研究抗性類型間的關(guān)系利于更好地利用小麥的遺傳抗性。絕大多小麥抗赤霉病遺傳研究集中在抗擴展(TypeⅡ)類型，然而應(yīng)用最為廣泛的抗赤霉病擴展基因Fhb1不能降低籽粒的抗毒素累積能力[12]。小麥抗性機制復(fù)雜，我國抗赤霉病育種實踐多采用病情指數(shù)或病小穗率作為抗性鑒定指標(biāo)，但后期感染或品種的主動解毒機制會導(dǎo)致DI與毒素累積量低相關(guān)甚至無相關(guān)性。由于檢測技術(shù)和成本等原因，很多育種家們在研究小麥赤霉病抗性時并沒有測量籽粒中真菌毒素的含量，然而隨著赤霉病毒素污染問題的日益嚴(yán)重，我們應(yīng)該加強對此類問題的重視。本研究通過對91份小麥品種(系)構(gòu)建的自然群體進(jìn)行田間病情指數(shù)調(diào)查，并對籽粒中DON、NIV含量進(jìn)行測定，探究小麥赤霉病抗侵染和抗毒素積累之間的關(guān)系；并結(jié)合90K SNP芯片，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析獲得與小麥赤霉病病情指數(shù)和毒素積累量顯著關(guān)聯(lián)的位點，發(fā)掘相關(guān)候選基因，以期為小麥赤霉病分子標(biāo)記輔助選擇提供信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種(系)共91份，包含66份黃淮南片冬小麥區(qū)品種、13份長江中下游品種、7份西南麥區(qū)品種、1份北方麥區(qū)品種以及4份國外品種。分別于2019—2020年、2020—2021年種植于安徽省合肥市郭河安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)皖中試驗站小麥赤霉病自然發(fā)病鑒定區(qū)。

1.2 小麥赤霉病田間病情指數(shù)調(diào)查

種植材料的乳熟中后期，從每份小麥品種中隨機選取50穗，對91份小麥赤霉病的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查并統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果。病情指數(shù)計算公式如下：

病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15796—2011《小麥赤霉病測報技術(shù)規(guī)范》[13]。0級：無病穗；1級：感病小穗占全部小穗25%以下；2級：感病小穗占全部小穗25%～50%；3級：感病小穗占全部小穗50%～75%；4級：感病小穗占全部小穗75%以上。

1.3 超高效液相色譜(UPLC)法測定小麥真菌毒素

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及樣品前處理 分別取 1 mg DON標(biāo)準(zhǔn)品、1 mg NIV標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液溶解成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。再分別取等量100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液混合成50 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)液置于-20 ℃冰箱備用。選用流動相水 ∶乙腈(體積比50 ∶50)稀釋 50 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)液10.00、8.00、5.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL的混合工作液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

將待測的小麥籽粒樣品磨碎混勻，稱取25.0 g樣品置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈 ∶水(體積比84 ∶16)混合溶劑，35 ℃超聲萃取 30 min，靜置后用定量濾紙進(jìn)行過濾，隨之吸取8 mL濾液于試管中，并加入80 μL乙酸，經(jīng)Mycosep#226多功能凈化柱凈化，吸取4 mL流出液，于 55 ℃氮吹至干。在底物中加入1 mL流動相(水 ∶乙腈體積比 50 ∶50)溶解，超聲后過0.22 μm有機濾膜待上機檢測。

1.3.2 色譜條件 選取的色譜條件如下：色譜柱：C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；檢測波長：λ=240 nm；機器檢測流動相為A相超純水(含0.1%乙酸)、B相乙腈；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序見表1。DON、NIV含量用安捷倫高效液相色譜自帶工作站分析，根據(jù)保留時間定性，用峰面積外標(biāo)法定量，最終結(jié)果取重復(fù)測量3次后的平均值。

1.4 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計、群體結(jié)構(gòu)與關(guān)聯(lián)分析

表型數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0及Excel 2019進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析，用R語言計算3種性狀的廣義遺傳力(h2)，計算公式為h2=σg2/(σg2+σe2)[14]，其中：σg2表示遺傳方差，σe2表示環(huán)境方差。利用90K SNP芯片對91份小麥品種進(jìn)行基因型分型，去除缺失率>15%，最小等位基因頻率<5%的SNP標(biāo)記。

表1 梯度洗脫程序

用 Structure 2.3.4 軟件對91份小麥材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置模擬迭代循環(huán)次數(shù)為50 000，運行迭代參數(shù)為100 000，群體參數(shù)K為1～11，每個K獨立運行6次，選取最大ΔK對應(yīng)的K值作為最佳亞群數(shù)量。

用Tassel 5.0軟件中的混合線性模型(mixed linear model，簡稱MLM)，以群體結(jié)構(gòu)分析后的Q值和親緣關(guān)系K值作為協(xié)變量，結(jié)合相關(guān)的表型數(shù)據(jù)和SNP位點的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在一定程度上控制遺傳背景的影響，避免產(chǎn)生假陽性。當(dāng)標(biāo)記的-lgP>3，即P<0.001時認(rèn)為性狀與標(biāo)記存在顯著關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

由91份小麥品種(系)的表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果(圖1、表2)可知，病情指數(shù)變幅為2.0～90.5，DON含量范圍為34.0～2 997.7 μg/kg，NIV含量范圍為 48.0～1 293.5 μg/kg，變異系數(shù)范圍為23.07%～69.31%，說明該自然群體的性狀變異范圍廣，選擇潛力較大，赤霉病抗性在不同小麥品種中差異顯著。廣義遺傳力結(jié)果表明，3個性狀的遺傳力均大于60%，表明赤霉病抗性受遺傳變異的影響較大，環(huán)境對其影響較小。

表2 表型數(shù)據(jù)基本統(tǒng)計信息

2.2 不同抗性指標(biāo)的相關(guān)性分析

病情指數(shù)和籽粒中DON、NIV含量分別作為品種籽?？骨秩竞涂苟舅胤e累的指標(biāo)。通過對2年內(nèi)小麥病情指數(shù)和DON、NIV含量的相關(guān)性分析(圖2)可知，在毒素積累量上，NIV含量與DON含量呈顯著正相關(guān)。在毒素含量和病情指數(shù)的關(guān)系中，2020年的DON含量與病情指數(shù)沒有顯著的相關(guān)性，2021年的DON含量與病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)。2年的NIV含量與病情指數(shù)均呈顯著正相關(guān)。在病情指數(shù)相同的情況下，毒素含量可能不同，病情指數(shù)高的品種，毒素含量卻不一定高，如Glenlen、皖52、川麥42等。毒素含量高的品種，病情指數(shù)可能不高，如荔高6號、皖麥38等。綜上表明，赤霉病病情指數(shù)與毒素含量之間存在一定的相關(guān)性，具有各自的遺傳特征。

2.3 標(biāo)記分布與群體結(jié)構(gòu)分析

分型質(zhì)控后的21 968個SNP標(biāo)記分布在小麥的21條染色體上。標(biāo)記在A、B、D基因組間分布不均勻，其中B基因組的標(biāo)記數(shù)最多，占總標(biāo)記數(shù)的44.10%，D基因組的標(biāo)記數(shù)最少，占總標(biāo)記數(shù)的16.85%。物理圖譜總長度為14 043.9 Mb，標(biāo)記密度為0.639 Mb/marker。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果使用Structure Harvest在線工具進(jìn)行計算，當(dāng)K=2時，運行結(jié)果最接近真實值，即這91份種質(zhì)材料可大致被分為2個亞群，群體結(jié)構(gòu)較為簡單。

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

將91份供試小麥材料的病情指數(shù)、DON含量和NIV含量與21 968個SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖3)，在P<0.001時，認(rèn)為該位置的標(biāo)記與性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。GWAS結(jié)果共檢測到128個顯著SNP標(biāo)記，分布在除1D、4D外的19條染色體上。其中，檢測到與病情指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有30個，可解釋11.32%～18.90%的表型變異。與DON積累量顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記共56個，可解釋11.89%～22.29%的表型變異。與NIV顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有42個，表型變異貢獻(xiàn)率為13.03%～34.11%。將在物理圖譜上前后3 Mb區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記認(rèn)為1個候選位點，在2個及以上環(huán)境中關(guān)聯(lián)到的穩(wěn)定位點有11個(表3)，其中僅與毒素穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的位點有6個，分別在1A、4A、6A、6B、6D染色體上，可解釋11.96%～30.50%的表型變異。與毒素和病情指數(shù)都穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的位點有4個，分別位于2A、2B、4B、5D染色體上，可解釋12.21%～34.11%的表型變異。

2.5 候選基因預(yù)測

參考中國春小麥品種的基因組信息，對穩(wěn)定的位點對應(yīng)區(qū)段內(nèi)基因進(jìn)行分析，結(jié)合相關(guān)生物信息挖掘候選基因。通過對應(yīng)的區(qū)段基因注釋，篩選得到15個與小麥赤霉病抗性相關(guān)的候選基因(表4)。其中TraesCS2A01G633200LC和TraesCS6D01G380900編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶T3(glutathioneS-transferase T3)，TraesCS2A01G474700等3個基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)，TraesCS2A01G476500等5個基因編碼病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein 1，簡稱PR1)，TraesCS2B01G040000編碼 12-氧代植物二烯酸還原酶(12-oxophytodienoate reductase-like protein)，TraesCS6D01G383000編碼葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡萄糖苷酶(glucan endo-1，3-beta-glucosidase)，TraesCS6D01G383700編碼受體激酶蛋白(receptor-like kinase，簡稱RLK)。

表3 穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的位點信息

表4 篩選獲得的與小麥赤霉病抗性相關(guān)的候選基因信息

3 討論與結(jié)論

近年來，受秸稈還田、輪作制度和極端天氣影響，赤霉病對我國小麥主產(chǎn)區(qū)的威脅逐漸北移。小麥赤霉病的發(fā)生不僅影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，一旦毒素累積量超標(biāo)喪失商品價值等于絕收，嚴(yán)重威脅人民生命健康和國家糧食安全。抗毒素積累在很多歐美國家的小麥赤霉病育種中越發(fā)受到重視，在加拿大用于評估赤霉病抗性品種的公式中，DON含量已經(jīng)占據(jù)了最高的權(quán)重[15]，然而在我國還沒有引起足夠的重視。小麥的病情指數(shù)與籽粒毒素累積量分別是抗擴展(TypeⅡ)和抗毒素累積(Type Ⅲ)抗性的評價指標(biāo)，本研究結(jié)果表明二者存在一定的相關(guān)性，但又有各自的遺傳特征。徐飛等的研究表明，不同小麥品種的平均病害嚴(yán)重度與籽粒中毒素含量存在極顯著正相關(guān)[16]。陳懷谷等研究認(rèn)為，病小穗率和毒素含量具有一定的相關(guān)性，但在不同年度間表現(xiàn)不同，也初步證明二者可能不是由同種基因所控制的[17]。鞏性濤等發(fā)現(xiàn)，小麥中赤霉病粒含量和DON含量不存在完全對應(yīng)的線性關(guān)系，不能以赤霉病粒含量的多少來預(yù)測籽粒中DON含量[18]。在我國的西北地區(qū)氣候干燥，赤霉病很少發(fā)生，但2018年的一項調(diào)查表明，在這些地區(qū)82.9%的小麥樣品被DON污染，平均濃度為0.5 mg/kg，10%的樣品DON含量高于我國規(guī)定的限量值[19]。有些小麥的毒素含量高可能是存在晚期感染的可能性，有研究表明，晚期感染通常不會引起明顯的赤霉病癥狀，但會導(dǎo)致DON的高積累量[20]。

小麥的基因組較為龐大，以往關(guān)聯(lián)分析多采用簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，SNP標(biāo)記的分布更廣且定位精度較好，逐漸成為QTL定位的主流。本研究將親緣關(guān)系納入到混合線性模型中，采用MLM+Q+K相結(jié)合的方法，即使群體的數(shù)量不大，也可以表現(xiàn)出較好的關(guān)聯(lián)能力，增加了關(guān)聯(lián)結(jié)果的準(zhǔn)確性。小麥赤霉病抗性由主效基因和微效基因共同控制，是極為復(fù)雜的數(shù)量性狀。本研究在2年間定位到的位點不完全一致，可能存在環(huán)境條件的影響，一些抗性基因在特定的情況下能夠表達(dá)，同時還會受到關(guān)聯(lián)群體大小、分子標(biāo)記密度等多種因素影響。本研究中，關(guān)于病情指數(shù)共檢測到30個顯著相關(guān)的SNP位點，其中2D染色體上的QFhb.ahau-2D在2年被重復(fù)檢測到，且表型貢獻(xiàn)率達(dá)16.82%～17.47%；關(guān)于DON累積量的顯著關(guān)聯(lián)位點56個，其中QFhb.ahau-1A-2、QFhb.ahau-4A、QFhb.ahau-6A和QFhb.ahau-6B位點在2年中均被檢測到。Semagn等在染色體1AL、1BL、6BS和7AL上發(fā)現(xiàn)了與赤霉病抗性相關(guān)的QTL，同時還可以減少DON的含量，其中1AL上的標(biāo)記位置與本研究的QFhb.ahau-1A-1位置較為接近[21]。Fhb.ahau-2A在3個性狀中都能關(guān)聯(lián)到，與鄭彤整理的高置信度一致性數(shù)量性狀位點(meta quantitative trait loci，簡稱MQTL)區(qū)間hcMQTL-12屬同一位置[22]，且該位點也與TypeⅡ和TypeⅢ抗性關(guān)聯(lián)。He等在3BL和3DL染色體上發(fā)現(xiàn)了2個對減少DON含量有顯著作用的QTL[15]，前者對TypeⅡ和Type Ⅳ型抗性影響較小，后者則沒有影響；雖然全球范圍內(nèi)關(guān)于赤霉病抗性QTL的研究較多，但由于試驗材料和研究方法的不同，共同定位的標(biāo)記較少且不穩(wěn)定，因此挖掘和鑒定QTL在目前的條件下仍然是必要的。

本研究根據(jù)中國春參考基因組注釋信息，預(yù)測了穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點區(qū)段內(nèi)的候選基因。其中TraesCS2A01G633200LC和TraesCS6D01G380900編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶T3，它在生物體的防御機制中具有解毒的功效[23]。Fhb7編碼的蛋白能使DON的環(huán)氧基團打開，并催化其形成谷胱甘肽加合物(DON-GSH)，從而產(chǎn)生解毒效應(yīng)[24-25]。編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的TraesCS2A01G474700等3個基因可能在毒素解毒和赤霉病抗性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，在大麥中表達(dá)的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶HvUGT13248當(dāng)在轉(zhuǎn)基因小麥中表達(dá)時，可以使DON、NIV解毒且明顯提高了NIV的抗性，提出可以將該基因作為抗赤霉病的候選基因[27]。TraesCS2B01G040000編碼的12-氧代植物二烯酸還原酶可能參與信號分子氧化脂質(zhì)的合成與代謝。植物氧化脂質(zhì)中的茉莉酸對禾谷鐮刀菌的生長有抑制作用，其啟動相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)，從而提高小麥赤霉病抗性[28]。TraesCS6D01G383700編碼受體激酶蛋白，在識別病原體相關(guān)分子模式和調(diào)節(jié)植物入侵真菌的免疫反應(yīng)(包括谷物對真菌疾病的防御)中發(fā)揮重要作用，據(jù)報道可以響應(yīng)DON以及抗赤霉病擴展[29]。TraesCS2A01G476500等基因編碼病程相關(guān)蛋白PR1，AtNPR1在易感病小麥中表達(dá)時，調(diào)節(jié)系統(tǒng)獲得抗性的激活，可以提高小麥抗赤霉病擴展能力[30]。TraesCS6D01G383000編碼的葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡萄糖苷酶在溫室和大田條件下均能增強小麥對赤霉病的抗性并減少DON積累量[31]。防衛(wèi)素以及其他一些富含半胱氨酸的蛋白可以與磷脂質(zhì)和鞘脂互相作用，破壞真菌的細(xì)胞膜[32]，阻止病原菌入侵。