郭文娟，孫慶玲，李婷，魏明清，倪敬年，時晶

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是導(dǎo)致腦小血管疾病的主要原因［1-2］，也是認知功能下降和神經(jīng)退行性改變的主要致病因素［3-4］。目前，大鼠和小鼠CCH模型構(gòu)建方法包括雙側(cè)頸總動脈閉塞（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法、雙側(cè)頸總動脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）法、雙側(cè)椎動脈+雙側(cè)頸總/內(nèi)動脈結(jié)扎（bilateral vertebral artery+bilateral common/internal carotid artery ligation，4VO）法、漸進式頸總動脈狹窄（gradual common carotid artery stenosis，GCAS）法和非對稱性頸總動脈縮窄（asymmetric common carotid artery stenosis，ACAS）法，其中臨床應(yīng)用最廣泛的是微彈簧BCAS法，但微彈簧成本較高，且無法采用MRI進行掃描；如采用離體腦組織進行MRI檢查又無法繼續(xù)實驗，且檢測結(jié)果與真實結(jié)果之間可能存在誤差。因此，優(yōu)化CCH模型構(gòu)建方法對腦小血管疾病和血管性認知障礙發(fā)病機制、病理特征、治療方法的研究非常重要。本次實驗參照MANSOUR等［5］改良版BCAS法構(gòu)建CCH大鼠模型的方法，使用一個非固定29號鈍針使頸動脈縮窄，但不留在體內(nèi)的方法改良了微彈簧BCAS法，進而使小鼠滿足活體MRI掃描的條件，并分析改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型的認知功能，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2022年4—5月。選取30只雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量24～29 g，8～9周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司〔實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXY（北京）2019-0013〕。將所有小鼠隨機分為假手術(shù)組和模型組，各15只。所有小鼠被安置在恒溫（25 ℃）、相對濕度為40%～60%的環(huán)境中，每籠5只小鼠。所有小鼠的飼養(yǎng)符合實驗動物飼養(yǎng)管理規(guī)定，并遵循動物倫理和福利原則。

1.2 實驗方法 模型組小鼠采用改良微彈簧BCAS法構(gòu)建CCH模型，具體如下：通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用無菌器械沿小鼠頸部中部切開皮膚和皮下組織，采用玻璃分針緩慢分離迷走神經(jīng)，暴露兩側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）。使用直徑0.08 mm的非吸收外科縫合線，將直徑0.18 mm的鋼絲與CCA牢固結(jié)扎，見圖1；然后緩慢抽出鋼絲，觀察有血流通過則縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅分離兩側(cè)CCA，隨后縫合消毒。手術(shù)過程中保持直腸溫度為36.5～37.5 ℃。

圖1 改良微彈簧BCAS法構(gòu)建CCH模型示意圖Figure 1 Schematic diagram of CCH model constructed by improved microcoil BCAS method

1.3 MRI檢查 術(shù)后第1天采用1.5%～2.0%異氟烷麻醉小鼠，使用動物生理檢測器測量小鼠呼吸頻率，以70～80次/min為宜。采用Bruker7.0 T小動物磁共振成像設(shè)備（型號：BioSpec 70/16USR）進行MRI檢查，采用T2WI序列獲取全腦軸向圖像。小鼠俯臥在小動物MRI掃描床上，頭部固定在專用線圈內(nèi)，MRI掃描過程中通過鼻導(dǎo)管維持麻醉狀態(tài)。T2WI序列參數(shù)：TR 2 500 ms，TE 35 ms，F(xiàn)OV 20 mm×20 mm，層數(shù)20，層厚0.5 mm，矩陣256×256，掃頻時間5′20″，回波間隔11.667 ms。

1.4 激光散斑對比成像（laser speckle contrast imaging，LSCI）檢測小鼠腦血流量（cerebral blood flow，CBF）及低灌注區(qū)占比 所用儀器為激光散斑血流成像儀（SIM BFI HR Pro，武漢迅微光電技術(shù)有限公司生產(chǎn)），將三目立體顯微鏡（OLYMPUS生產(chǎn)）與計算機連接，進行實時定位和校準。術(shù)后第1天、1個月和2個月，分別從假手術(shù)組和模型組隨機挑選5只小鼠，稱重后腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，剪開小鼠頭頂皮膚并消毒，剝離骨膜暴露頭骨，將小鼠置于臺式顯微鏡下20 cm處。CBF檢測過程中，在小鼠頭骨頂部滴入0.9%氯化鈉溶液，以保持頂骨測試區(qū)域濕潤。LED光強度為4 000，光學(xué)倍數(shù)為12，亮度為1.5級，采樣頻率為57幀/s，曝光時間為15 ms，分辨率為1 024×758像素。利用Image J中的“Split Channels”功能對3個RGB通道進行分割統(tǒng)計，然后計算低灌注區(qū)占比［6］。

1.5 Morris水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力兩組小鼠均于術(shù)后2個月進行Morris水迷宮實驗，以評估其學(xué)習(xí)和記憶能力。Morris水迷宮實驗設(shè)備包括一個圓形水池（直徑100 cm，高50 cm）、一個平臺（直徑5 cm）、一架跟蹤攝像機和一臺電腦。將（23±1）℃的水注入水池至30 cm深度，水面高于平臺1 cm。將攝像機置于水池中心上方200 cm處，記錄動物的位置、游泳距離、游泳時間及游泳路徑。Morris水迷宮實驗分為定位導(dǎo)航和空間探索兩部分。實驗前5 d進行定位導(dǎo)航，將水池分為4個象限，平臺位于其中一個象限的中心。記錄動物找到水下平臺的時間（s），即逃避潛伏期。實驗前3 d，如果小鼠尋找平臺的時間超過60 s，則引導(dǎo)其到平臺停留10 s。實驗第4、5天，無論小鼠是否找到平臺，都不再進行訓(xùn)練。實驗第6天進行空間探索，將平臺移走，將小鼠從原平臺象限的對面放入水中，記錄其在60 s內(nèi)穿過平臺象限的次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。本研究計量資料均為偏態(tài)分布，以M（QR）表示，組間比較采用秩和檢驗，組內(nèi)比較采用配對秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI檢查結(jié)果 T2WI顯示，術(shù)后第1天兩組小鼠均未發(fā)生急性腦梗死及其他異常改變。

2.2 CBF和低灌注區(qū)占比 術(shù)后第1天、1個月、2個月，模型組小鼠CBF少于假手術(shù)組，低灌注區(qū)占比高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后1個月、2個月，模型組小鼠CBF多于術(shù)后第1天，低灌注區(qū)占比低于術(shù)后第1天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠術(shù)后不同時間CBF和低灌注區(qū)占比比較〔M（QR），n=5〕Table 1 Comparison of CBF and proportion of hypoperfusion area between the two groups at different time after operation

2.3 游泳距離、逃避潛伏期、60 s內(nèi)穿過平臺次數(shù) 實驗第1、2天，兩組小鼠游泳距離比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗第3、4、5天，模型組小鼠游泳距離長于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗第1、2、3、4、5天，模型組小鼠逃避潛伏期長于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。實驗第6天，假手術(shù)組小鼠60 s內(nèi)穿過平臺象限的次數(shù)為1（2）次，多于模型組的0（1）次，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U=391，P＜0.05）。

表2 兩組小鼠訓(xùn)練不同時間游泳距離和逃避潛伏期比較〔M（QR），n=15〕Table 2 Comparison of swimming distance and escape latency between the two groups at different training time

3 討論

CCH是血管性認知障礙、癡呆的主要發(fā)病機制，故CCH模型的構(gòu)建方法一直被不斷探索。嚙齒類動物常被用于探索CCH或血管性癡呆發(fā)病機制、病理特征的基礎(chǔ)實驗中，其中C57BL/6J小鼠因后循環(huán)腦血管解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育不全［7］，可彌補后椎動脈代償供血情況，故被認為是構(gòu)建CCH的理想動物。MANSOUR等［5］提出使用直徑為0.18 mm的微彈簧縮窄C57BL/6J小鼠CCA，可避免BCCAO法構(gòu)建CCH模型誘發(fā)的視神經(jīng)損傷［7］，且術(shù)后即刻小鼠CBF明顯減少，術(shù)后30 d可恢復(fù)到術(shù)前的80%［8］，進而成功模擬CCH狀態(tài)。

既往研究表明，CCH小鼠模型可再現(xiàn)血管性認知障礙的臨床特征和病理特征，引起小鼠認知障礙、CBF減少、皮質(zhì)下白質(zhì)損傷［9-11］及空間記憶功能損傷［12］。但微彈簧的金屬材質(zhì)無法用于MRI掃描，且其價格昂貴。而本研究中改良微彈簧BCAS法是采用縫合線代替微彈簧來縮窄CCA，進而實現(xiàn)了活體MRI掃描，且可以降低建模成本。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第1天、1個月、2個月，模型組小鼠CBF少于假手術(shù)組；術(shù)后1、2個月，模型組小鼠CBF多于術(shù)后第1天；提示模型組小鼠術(shù)后2個月仍維持低灌注狀態(tài)。本研究結(jié)果還顯示，術(shù)后第1天、1個月、2個月，模型組小鼠低灌注區(qū)占比高于假手術(shù)組，模型組小鼠低灌注區(qū)占比低于術(shù)后第1天，再次佐證了模型組小鼠可以維持低灌注狀態(tài)。且模型組小鼠術(shù)后第1天未發(fā)生急性腦梗死及其他異常改變，這與微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型一致［13］。本研究結(jié)果還顯示，實驗第3、4、5天，模型組小鼠游泳距離長于假手術(shù)組；實驗第1、2、3、4、5天，模型組小鼠逃避潛伏期長于假手術(shù)組；實驗第6天，模型組小鼠60 s內(nèi)穿過平臺象限的次數(shù)多于假手術(shù)組，提示通過改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型可損傷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

綜上所述，通過改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型彌補了微彈簧無法進行活體MRI掃描的缺陷，且能維持低灌注狀態(tài)，小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶能力受損，這為探究CCH發(fā)病機制提供了新的建模思路。

作者貢獻：郭文娟、李婷、時晶進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；郭文娟、孫慶玲、李婷進行研究的實施與可行性分析；郭文娟、李婷進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；孫慶玲、李婷、魏明清、倪敬年進行結(jié)果分析與解釋；郭文娟負責撰寫、修訂論文；時晶負責文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。