吳會芳，張景麗，劉曉娟，吳曉杰，段晨初，張中平

(河北省兒童醫(yī)院呼吸三科，河北 石家莊 050031)

兒童慢性肺炎為病程遷延超過3個月的肺部炎癥性疾病，因病情反復(fù)發(fā)作、治療難度大，且患兒正處于生長發(fā)育期，對其生長發(fā)育造成了嚴(yán)重的影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，兒童慢性肺炎的發(fā)生伴有多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)，了解相關(guān)因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，對于治療方案的制定有重要指導(dǎo)作用[2-3]。在肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中，炎性細(xì)胞因子造成的炎癥浸潤及過氧化氫等引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞損傷是其重要病理特征[4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，被證實與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)在自身免疫及氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)方面有重要作用，參與炎癥因子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥損傷；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是與器官組織損傷密切相關(guān)的糖酵解酶，臨床常用于疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的評價[5-6]。目前HMGB1、GM-CSF、LDH在兒童慢性肺炎中的變化仍未明確，本研究主要探究在慢性肺炎患兒中，外周血HMGB1與GM-CSF及LDH水平的表達(dá)及關(guān)系，為此類疾病的診療提供循征指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年3月—2020年3月收治入院的慢性肺炎患兒66例，為肺炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡3～14歲；符合《諸福棠實用兒科學(xué)》中對慢性肺炎的診斷[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、哮喘等其他呼吸道疾病者；存在其他組織及器官感染者、凝血功能障礙及免疫缺陷者；生命體征不穩(wěn)定者。肺炎組中男性36例，女性30例，患兒年齡3～14歲，平均(8.62±2.25)歲；病程3～9個月，平均(6.09±1.32)個月，其中重癥30例，輕癥36例。另選取同期健康體檢兒童80名，男性42名，女性38名，年齡3～14歲，平均(8.80±2.44)歲。2組受檢兒童的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),具有可比性。

研究在實施前已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且受檢兒童家長均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及檢測 肺炎組兒童于入院當(dāng)日抽取外周靜脈血5 mL，對照組兒童于體檢當(dāng)日抽取，血液標(biāo)本采集于未加抗凝劑的生化管中，以3 500 r/min離心5 min，半徑12 cm，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。以抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測HMGB1、GM-CSF：TMB顯色，對標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L濃度，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，各濃度標(biāo)準(zhǔn)平中加樣50 μL，樣品稀釋液和代檢測樣品為40 μL和10 μL，輕輕晃動使其混勻，封板膜封板，置于37 ℃環(huán)境下孵育0.5 h，洗滌(棄液體、甩干后添加洗滌液，靜置30 s后棄液體，重復(fù)5次)，拍干后除空白孔外各反應(yīng)孔加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體50 μL，37 ℃環(huán)境下孵育0.5 h，洗滌，加底物顯色液，37 ℃環(huán)境下避光顯色10 min，于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸50 μL，終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫吸附測定儀上，空白孔調(diào)整為0，于450 nm波長處測量各孔的吸光度值，以Curve Expert軟件分析，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，樣本OD值帶入，計算樣品實際濃度。以全自動分析儀速率法檢測LDH水平。

1.2.2肺炎患兒病情嚴(yán)重程度及分組[8]重癥肺炎診斷：合理應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素超過7 d體溫仍無明顯變化，影像學(xué)檢查提示存在肺葉高密度實變，存在肺不張、雙肺廣泛間質(zhì)浸潤、支氣管擴(kuò)張；合并胸腔積液/壞死性肺炎及肺膿腫等并發(fā)癥。將符合重癥肺炎診斷者納入重癥組，否則為輕癥組。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用獨立樣本t檢驗，Pearson相關(guān)性分析法進(jìn)行HMGB1、GM-CSF、LDH的相關(guān)性評價，以受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評價相關(guān)指標(biāo)對疾病的評估價值，以曲線下面積(area under the curve，AUC)>0.7表示病情評估效能較好。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比較 肺炎組患兒血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比較Table 1 Comparison of serum HMGB1, GM-CSF and LDH levels in two groups

2.2重癥組與輕癥組血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比較 66例患兒中30例符合對重癥肺炎的判斷，重癥組的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于輕癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 重癥組與輕癥組血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比較Table 2 Comparison of serum HMGB1, GM-CSF and LDH levels between severe pneumonia group and mild pneumonia group

2.3肺炎組中血清HMGB1、GM-CSF、LDH的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，血清HMGB1與GM-CSF及LDH水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，且LDH與GM-CSF水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 血清HMGB1、GM-CSF、LDH的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of serum HMGB1, GM-CSF and LDH

圖1 血清HMGB1與GM-CSF和LDH的Pearson相關(guān)性分析散點圖

2.4HMGB1、GM-CSF、LDH對慢性肺炎患兒病情嚴(yán)重程度的評估價值 ROC曲線分析顯示，獲得最大約登指數(shù)時HMGB1、GM-CSF、LDH的最佳截斷點分別為11.26 μg/L、16.89 μg/L、335.41 U/L，此時HMGB1、GM-CSF、LDH聯(lián)合判斷重癥慢性肺炎的AUC為0.906，高于三者單獨檢測0.790、0.787和0.781，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 HMGB1、GM-CSF、LDH對慢性肺炎患兒病情嚴(yán)重程度的評估結(jié)果Table 4 Evaluation results of HMGB1, GM-CSF and LDH on severity of chronic pneumonia in children

圖2 HMGB1、GM-CSF、LDH評估重癥慢性肺炎的ROC曲線結(jié)果

3 討 論

支氣管發(fā)育異常、呼吸道異物、先天性心臟病、既往肺部疾病未痊愈及營養(yǎng)不良等多種因素均可造成兒童慢性肺炎，因該病的臨床癥狀無明顯的特異性，與普通的呼吸道感染癥狀相似，易被忽視而延誤治療[9]。慢性的肺部炎癥可反復(fù)周期性發(fā)作，隨著病程的延長逐漸累及內(nèi)分泌、循環(huán)及消化等多個系統(tǒng)，增加并發(fā)癥及肺源性心臟病發(fā)生風(fēng)險，威脅患兒健康[10]。研究認(rèn)為，炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)異常參與肺炎的發(fā)生發(fā)展中，且細(xì)胞因子作為實驗室檢測指標(biāo)在病情的診斷及治療方面有重要的指導(dǎo)意義[11]。故通過了解慢性肺炎患兒中異常表達(dá)細(xì)胞因子及與病情的相關(guān)性，對于指導(dǎo)治療方案的制定有重要作用。

目前臨床對于肺部炎癥的診斷多使用白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白等快速檢測項目，雖可對炎癥程度的判斷有一定指導(dǎo)作用，但敏感性和特異性不慎理想，仍需尋求更加特異性指標(biāo)。HMGB1是HGMB蛋白家族成員，主要存在于細(xì)胞核中，通過參與修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和重組及基因組穩(wěn)定性等維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[12]。研究發(fā)現(xiàn)，單核巨噬細(xì)胞在白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子α等炎癥介質(zhì)刺激下，能使HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿，并以蛋白質(zhì)非經(jīng)典途徑分泌至細(xì)胞外，成為炎癥細(xì)胞因子，參與多種炎癥和自身免疫性疾病的過程[13]。Le等[14]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1參與肺巨噬細(xì)胞引起氣道炎癥和肺結(jié)構(gòu)的破壞，提示HMGB1在肺炎的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。GM-CSF是炎癥因子和細(xì)胞脂多糖作用于多種細(xì)胞的產(chǎn)物，亦可在抗原刺激下由活化的免疫細(xì)胞分泌，具有造血和免疫調(diào)節(jié)作用，參與多種粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括肺泡巨噬細(xì)胞的分化[15]。研究表明，GM-CSF能趨化多種炎癥細(xì)胞生成過氧化物酶，誘發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[16]。Bonaventura等[17]發(fā)現(xiàn)，包括GM-CSF等在內(nèi)的炎癥性細(xì)胞因子的增殖可驅(qū)動新型冠狀病毒肺炎的肺損傷。LDH作為一種細(xì)胞質(zhì)酶，廣泛分布于心、肝、肺、淋巴等組織及器官中，幾乎表達(dá)于所有類型細(xì)胞中，在器官和組織損傷后均可釋放入血，即使有輕微的損傷，其所釋放的LDH也可使血清中的水平明顯升高，因此是非特異性且敏感性高的炎癥標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示，肺炎組的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于對照組，且重癥組水平均高于輕癥組，提示HMGB1、GM-CSF、LDH參與兒童慢性肺炎的發(fā)生發(fā)展，具有兒童慢性肺炎感染性生物標(biāo)志物的研究價值。

對HMGB1、GM-CSF、LDH判斷兒童慢性肺炎的嚴(yán)重程度評估價值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三者的AUC分別為0.790、0.787和0.781，評估效能較高，而三者聯(lián)合的AUC為0.906，高于單獨評估，提示聯(lián)合使用對兒童慢性肺炎的嚴(yán)重程度評估價值更高。研究表明HMGB1屬于晚期炎癥因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，被刺激活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞能分泌HMGB1，使其形成正反饋環(huán)，其在炎癥反應(yīng)中處于中心位置，能與多種受體結(jié)合引起細(xì)胞因子和趨化因子釋放，維持長期炎癥狀態(tài)，符合慢性肺炎病情發(fā)展規(guī)律[20]。中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞因子的聚集是肺部炎癥損傷的重要病理特征，GM-CSF可受炎癥細(xì)胞因子增殖驅(qū)動的影響，其水平的升高說明肺部處于炎癥狀態(tài)中[21]。黎明等[22]研究顯示在難治性肺炎支原體肺炎治療后GM-CSF較治療前有明顯下降，說明GM-CSF可反應(yīng)病情變化，對肺炎病情判斷有一定價值。LDH雖非是肺炎的特異性指標(biāo)，但其對機(jī)體炎癥有較高的敏感性，陳慶元等[23]認(rèn)為，在支氣管肺炎患兒中血清LDH與免疫功能相關(guān)，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，對于疾病的發(fā)生進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸的判斷有良好的價值。因此將HMGB1、GM-CSF、LDH聯(lián)合檢測對兒童慢性肺炎病情進(jìn)行判斷，能綜合三項指標(biāo)的生理病理判斷優(yōu)勢，更好的反應(yīng)肺部炎癥損傷狀態(tài)，對病情的客觀評估有更高價值。

綜上所述，慢性肺炎患兒存在外周血HMGB1、GM-CSF、LDH異常升高情況，且三者互為正相關(guān)，三者聯(lián)合檢測對于患兒肺部炎癥程度的判斷有更高的評估價值。本研究的不足之處在于慢性肺炎患兒的病情發(fā)生發(fā)展受多因素影響，HMGB1、GM-CSF、LDH僅對已發(fā)生病情作出評價，在疾病預(yù)防及篩查方面意義不大，后續(xù)計劃從基因遺傳方面探討影響慢性肺炎的相關(guān)因素，為慢性肺炎的防治提供更有價值的參考。