張秋宏，蔣日進(jìn)，劉明智，王 靜，肖 祎，楊 凡，周永東，馮廣朋

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

刀鱭Coilia nasus屬鯡形目Clupeiformes 鳀科Engraulidae 鱭屬Coilia，是一種主要生活在我國(guó)長(zhǎng)江流域的溯河洄游型魚類。刀鱭味道鮮美，深受廣大人民喜愛，同鰣魚Tenualosa reevesi、暗紋東方鲀Takifugu obscurus有“長(zhǎng)江三鮮”的美譽(yù)[1]。刀鱭歷史的最大漁獲量高達(dá)3 750 t，是長(zhǎng)江下游流域及河口水域的重要經(jīng)濟(jì)魚種[2]。但是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，長(zhǎng)江口的水域污染加劇、生態(tài)環(huán)境的惡化以及在過度捕撈的影響下，使得漁業(yè)資源受到了嚴(yán)重的威脅，刀鱭也處于瀕危保護(hù)狀態(tài)[3]。增殖放流對(duì)于漁業(yè)資源恢復(fù)、保護(hù)魚類種群、滿足人們對(duì)于水產(chǎn)品的需求以及生態(tài)水域平衡都起到重要作用，因此開展刀鱭的人工增殖放流，就顯得尤為關(guān)鍵[4]，與此對(duì)應(yīng)的標(biāo)記放流方法選擇也具有了重要的意義。常用的魚類標(biāo)記方法分為體內(nèi)標(biāo)記法、體外標(biāo)記法、分子遺傳標(biāo)記法、生物遙測(cè)法、化學(xué)標(biāo)記法等[5]。本文研究的茜素絡(luò)合物（alizarin complexone,ALC）和六水合氯化鍶（hexahydrate strontium chloride）對(duì)于刀鱭耳石的標(biāo)記方法屬于化學(xué)標(biāo)記法，剪鰭標(biāo)記方法屬于體外標(biāo)記法[6]，合適的標(biāo)記技術(shù)選擇是標(biāo)記放流成功的關(guān)鍵，重點(diǎn)關(guān)注死亡率和標(biāo)記保留時(shí)間[7]。本文著重從死亡率方面對(duì)3 種標(biāo)記方法進(jìn)行初步探索，其目的是為了對(duì)比3 種標(biāo)記方法的死亡率差異，為后續(xù)的刀鱭幼魚增殖放流合適標(biāo)記方法的選擇提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用刀鱭魚苗都為上海市水產(chǎn)研究所奉賢基地培育的40 日齡健康幼魚，體長(zhǎng)3～5 cm。

1.1.1 ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)材料

ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)開始前，在24 h 曝氣的水泥池中暫養(yǎng)5 d。水池每日清潔，吸污。水池溫度27.4～28.1 ℃，鹽度為1.3～1.4，暫養(yǎng)用水呈弱堿性。暫養(yǎng)期間，分別于09:00 和16:00 1 d 2 次投喂人工培育的開口餌料，每日清理培育池1 次，魚苗攝食正常，存活率良好。暫養(yǎng)結(jié)束后，魚苗轉(zhuǎn)入24 h 曝氣的培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)箱穩(wěn)定6 h 后開始浸泡染色實(shí)驗(yàn)，染色期間不喂食。染色所用試劑為茜素絡(luò)合物（ALC），分子式C14H7NaO7S·H2O，分析純制劑，培養(yǎng)箱水溫為27.6～28.2 ℃，鹽度1.3～1.4，pH 為8.3～8.4 呈弱堿性。

1.1.2 鍶元素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)材料

鍶元素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)開始前，將幼魚放入24 h 曝氣培養(yǎng)箱中，暫養(yǎng)1 d，不投喂餌料，從第2 天起，每日吸污1 次，隔天換水50%，每次換水后，在標(biāo)記組中加入一定量的SrCl2·6H20 調(diào)節(jié)Sr2+的濃度。分別于09:00和16:00 每天2 次投喂人工培育的開口餌料。培養(yǎng)箱水溫為27.3～28.1℃，鹽度1.3～1.4，pH 為8.3～8.4 呈弱堿性。實(shí)驗(yàn)采用的SrCl2·6H2O 為分析純制劑，采購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)材料

剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)開始前，幼魚在24 h 曝氣水泥池中暫養(yǎng)5 d，水池每日清潔吸污，其環(huán)境和ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同。于09:00 和16:00 1 d 2 次投喂人工培育的開口餌料，暫養(yǎng)結(jié)束后在魚苗轉(zhuǎn)入前，將曝氣培養(yǎng)箱和剪鰭工具用高錳酸鉀稀釋溶液浸泡消毒30 min，在培養(yǎng)箱中穩(wěn)定6 h 后開始剪鰭實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料。培養(yǎng)箱水溫27.6～28.0 ℃，鹽度1.3～1.4，pH 為8.3～8.4 呈弱堿性。剪鰭標(biāo)志時(shí)，實(shí)驗(yàn)操作人員戴橡膠手套，隨機(jī)選取魚苗，左手輕握魚體，右手持眼科剪，按實(shí)驗(yàn)分組將魚體不同部位的鰭條沿鰭基部完全剪除，剪鰭失敗或剪鰭后活力明顯下降的魚不用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法

ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所用40 L 培養(yǎng)箱，初始每組20 尾刀鱭魚苗，浸泡過程中向水體中充氣，首次實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)ALC 標(biāo)記濃度，分別為0、50、100、150、200 mg·L-1，每個(gè)濃度下設(shè)3 個(gè)平行組，共15 個(gè)培養(yǎng)箱，用消毒燒杯盛裝已配制實(shí)驗(yàn)所需濃度浸泡液，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將各組刀鱭幼魚分別放入相應(yīng)濃度的培養(yǎng)箱中，持續(xù)浸泡時(shí)間為48 h，在實(shí)驗(yàn)中觀察其行為和中毒后的狀況，經(jīng)外界多次刺激無反應(yīng)認(rèn)定為死亡，將死亡的刀鱭撈出，分別記錄浸泡2、6、12、18、24、36 和48 h 的死亡數(shù)量，計(jì)算其累計(jì)死亡率。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)150、200 mg·L-1濃度浸泡的刀鱭幼魚個(gè)體在短時(shí)間內(nèi)全部死亡，100 mg·L-1濃度浸泡的死亡率也較高，但其死亡率有著明顯的下降趨勢(shì)。為了進(jìn)一步研究低濃度浸泡的效果，第2 次實(shí)驗(yàn)在外界環(huán)境和方法同第1 次實(shí)驗(yàn)相同的情況下分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)ALC 濃度為0、30、60 和90 mg·L-1，分別記錄浸泡6、12、18、24 和48 h 的死亡率。

1.2.2 鍶元素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法

鍶元素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)采用300 L 培養(yǎng)箱，每箱放入150 尾刀鱭幼魚，依據(jù)海水中的鍶含量，分別設(shè)置濃度為0、12、24、48、60 mg·L-1的鍶溶液進(jìn)行浸泡試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行組。標(biāo)記持續(xù)時(shí)間為8 d，每天每4 h 觀察1 次幼魚活動(dòng)情況，及時(shí)撈出死魚，并統(tǒng)計(jì)死亡情況。標(biāo)記結(jié)束后，將幼魚轉(zhuǎn)移至無鍶經(jīng)沉淀后的淡水水體中養(yǎng)殖，養(yǎng)殖環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同。

1.2.3 剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法

剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)采用40 L 培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)組（未剪鰭對(duì)照組、剪尾鰭標(biāo)志A 組、剪右胸鰭標(biāo)志B組、剪右腹鰭標(biāo)志C 組），對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置4 個(gè)平行組，每組放入20 尾魚。在剪鰭后的第1、2、4、6、8、24 h 觀察并記錄各組（包括對(duì)照組）魚的死亡、游泳行為等情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

刀鱭幼魚體長(zhǎng)體質(zhì)量可以表征其生長(zhǎng)情況，其二者關(guān)系可以用冪函數(shù)擬合，對(duì)刀鱭幼魚體長(zhǎng)體質(zhì)量數(shù)據(jù)分析，其公式為[8]：

式中：L為刀鱭幼魚體長(zhǎng)，mm；W表示刀鱭幼魚體質(zhì)量，g；a為生長(zhǎng)條件因子；b為冪指數(shù)系數(shù)。

本研究標(biāo)記后死亡率數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 23 軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記存活和死亡率

在ALC 標(biāo)記第1 次實(shí)驗(yàn)中，在100、150 和200 mg·L-1浸泡濃度下魚苗在較短時(shí)間內(nèi)死亡率較高，其中50 mg·L-1死亡率相對(duì)較低，在第2 次實(shí)驗(yàn)中，為了更精確探究茜素絡(luò)合物標(biāo)記死亡濃度，圍繞著50 mg·L-1濃度做出0、30、60 和90 mg·L-1，分別記錄浸泡6、12、18、24 和48 h 的死亡率并計(jì)算累計(jì)死亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）。結(jié)果表明對(duì)照組（0 mg·L-1）和其他標(biāo)記組呈顯著性差異（P＜0.05），30 和60 mg·L-1標(biāo)記組無顯著性差異（P＞0.05），60 和90 mg·L-1標(biāo)記組無顯著性差異（P＞0.05），其中不同小寫字母表示差異性顯著。

圖1 第二次實(shí)驗(yàn)茜素紅標(biāo)記下刀鱭幼魚累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality rate of C.nasus juveniles under the alizarin complex marking of in the second experiment

在鍶元素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，在不同濃度梯度下均發(fā)生死亡現(xiàn)象，但各個(gè)濃度下的刀鱭累計(jì)死亡率均處于較低水平，其中每天累計(jì)死亡率最高值對(duì)應(yīng)的是Sr2+濃度為24 mg·L-1，且累計(jì)死亡率隨著Sr2+濃度上升呈同向趨勢(shì)（圖2），通過對(duì)于不同濃度實(shí)驗(yàn)組累計(jì)死亡率同對(duì)照組進(jìn)行顯著性分析，得出結(jié)論是除24 mg·L-1濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05），其他均無顯著性差異（P＞0.05），其中不同小寫字母表示差異性顯著。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組鍶濃度對(duì)刀鱭幼魚死亡率影響很小。通過觀察實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記組與實(shí)驗(yàn)組幼魚攝食、游泳狀態(tài)均無差異。

圖2 刀鱭幼魚不同鍶濃度的累積死亡率Fig.2 Cumulative mortality rate of C.nasus juveniles in different strontium concentration

在剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)于刀鱭幼魚剪鰭標(biāo)記死亡個(gè)體在死亡前運(yùn)動(dòng)方式的觀察發(fā)現(xiàn)刀鱭被剪尾鰭放入暫養(yǎng)水箱后，平衡能力下降，尾部抖動(dòng)頻率加快，上下擺動(dòng)；一段時(shí)間后，失衡狀態(tài)繼續(xù)，魚苗開始頭部向下、尾部向上，左右擺動(dòng)，開始往角落游動(dòng)，身體晃動(dòng)頻率加快持續(xù)一小段時(shí)間，經(jīng)歷躺平-游動(dòng)-躺平等間歇，直至無力游動(dòng)、死亡。刀鱭被剪右胸鰭放入暫養(yǎng)水箱后，平衡和活躍能力明顯下降，大多在底層游動(dòng)，魚體偏向一側(cè)游動(dòng)；魚體明顯左右擺動(dòng)，東倒西歪，在水體底層或上層間歇性游動(dòng)，直至死亡。刀鱭被剪右腹鰭放入暫養(yǎng)水箱后，平衡能力尚好，未出現(xiàn)明顯的失衡狀態(tài)；一段時(shí)間后，魚體活躍能力下降，但游泳行為較正常；在魚體接近死亡前，出現(xiàn)游泳能力減弱，平衡能力下降等情況，直至死亡。

在剪鰭標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，通過單因素方差分析，其存活情況分析結(jié)果表明了除剪鰭后2 h 各組間存活率存在顯著性差異（P＜0.05）以外，其余時(shí)段各組間存活率差異不顯著（P＞0.05）（表1）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在前2 h 存活率為100%，于第4 h 存活率下降為99%，24 h 的最終存活率為99%。刀鱭幼魚24 h 最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果存活率由大到小表現(xiàn)為：對(duì)照組（99%）＞剪尾鰭（25.85%）＞剪右側(cè)腹鰭（15%）＞剪右側(cè)胸鰭（8.33%）。

表1 實(shí)驗(yàn)各組剪鰭后的存活率（%）Tab.1 Survival of each group after cut-fin（%）

2.2 體長(zhǎng)-體質(zhì)量關(guān)系

為了探究鍶元素標(biāo)記是否影響刀鱭幼魚的生長(zhǎng)，在各濃度的實(shí)驗(yàn)組各取10 尾標(biāo)記8 d 后的刀鱭幼魚，同對(duì)照組幼魚進(jìn)行體長(zhǎng)、體質(zhì)量的測(cè)量。其中實(shí)驗(yàn)組的平均體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別是39.23±4.33 mm、0.36±0.07 g，對(duì)照組平均體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別是39.70±5.08 mm、0.26±0.08 g（表2）。采用冪函數(shù)擬合刀鱭幼魚體長(zhǎng)-體質(zhì)量關(guān)系，結(jié)果如下：

表2 刀鱭標(biāo)記組與對(duì)照組體長(zhǎng)-體質(zhì)量關(guān)系參數(shù)值Tab.2 Parameter values of length-weight relationship in marked C.nasus juveniles and the controls

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組冪指數(shù)均不等于3，屬于異速生長(zhǎng)，且相差很?。▓D3）。通過進(jìn)一步探究鍶元素標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚體長(zhǎng)和體質(zhì)量影響，利用單因素方差分析，對(duì)各濃度體長(zhǎng)和體質(zhì)量與對(duì)照組進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組刀鱭幼魚體長(zhǎng)-體質(zhì)量關(guān)系與對(duì)照組均呈現(xiàn)不顯著差異（P＞0.05），說明該標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)影響不大，各濃度下的鍶元素標(biāo)記對(duì)于刀鱭幼魚的生長(zhǎng)干擾較小。

圖3 刀鱭幼魚體長(zhǎng)-體重關(guān)系Fig.3 Relationship of body length-weight in C.nasus juveniles

3 討論

3.1 茜素絡(luò)合物標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚死亡率的影響

熒光標(biāo)志物會(huì)在魚類耳石、硬骨組織以及魚類的鱗片中形成永久的標(biāo)記，現(xiàn)如今已有多種熒光物質(zhì)被研究應(yīng)用到魚類標(biāo)記中[9-11]。研究表明茜素絡(luò)合物有著較好的標(biāo)記效果，但不同魚種對(duì)于茜素絡(luò)合物敏感程度不同，且茜素絡(luò)合物浸泡濃度和魚類致死率呈正相關(guān)。歐陽斌等[11]利用茜素絡(luò)合物對(duì)稀有鮈鯽Gobiocypris rarus和彭澤鯽Carassius auratusvar.Pengze 仔稚魚標(biāo)記，當(dāng)浸泡濃度為30～100 mg·L-1（浸泡24 h）死亡率為0，在濃度為200 mg·L-1時(shí)，二者均出現(xiàn)100%死亡率；王正鯤等[12]發(fā)現(xiàn)唐魚Tanichthys albonubes幼魚在80和100 mg·L-1的茜素絡(luò)合物中浸泡24 h，死亡率均為0，而在150 和200 mg·L-1的浸泡濃度下死亡率分別達(dá)到44%和100%。付自東等[13]用茜素絡(luò)合物對(duì)胭脂魚Myxocyprinus asiaticus仔魚進(jìn)行浸泡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在濃度為50～200 mg·L-1的茜素絡(luò)合物（24 h）的死亡率為0，當(dāng)濃度到達(dá)250 mg·L-1時(shí)死亡率達(dá)到90%。趙亞鵬等[14]用茜素絡(luò)合物對(duì)滇池金線鲃Sinocyclocheilus grahami進(jìn)行標(biāo)記浸泡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為50～100 mg·L-1的茜素絡(luò)合物（浸泡4～8 h）滇池金線鲃仔魚死亡率為0；當(dāng)濃度達(dá)到150 mg·L-1時(shí)（浸泡8 h）仔魚死亡率為30%；當(dāng)濃度大于200 mg·L-1時(shí)90 d 滇池金線鲃稚魚全部死亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第1 次實(shí)驗(yàn)中較高浸泡濃度（100～200 mg·L-1）的茜素絡(luò)合物對(duì)于刀鱭幼魚有較高的致死率，當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·L-1刀鱭幼魚在6 h 內(nèi)全部死亡。在第2 次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置較低濃度梯度下的30、60、90 mg·L-1標(biāo)記組，隨著濃度上升死亡率也呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，這也同樣論證了上述觀點(diǎn)。就死亡率而言，濃度為30 mg·L-1的茜素絡(luò)合物是刀鱭幼魚相對(duì)適宜的浸泡濃度，但仍然有較高的死亡率。

3.2 鍶元素標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)影響

鍶元素廣泛存在于自然水域中，鍶元素含量與分布方式在不同水域中通常存在顯著差異（淡水區(qū)含量低、河口區(qū)中、海水區(qū)高）[15]。鍶元素標(biāo)記技術(shù)，所采用的浸泡的方式，具有便于操作、標(biāo)記信息持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)久、標(biāo)記苗種規(guī)格限制小等特點(diǎn)[16]。通過實(shí)驗(yàn)分析不同鍶濃度對(duì)刀鱭幼魚影響：Sr2+濃度為24 mg·L-1時(shí)，死亡率最高，分析其原因可能是吸污時(shí)人為操作不當(dāng)，造成幼魚損傷導(dǎo)致死亡。除24 mg·L-1濃度外，在0～60 mg·L-1范圍內(nèi)，鍶元素標(biāo)記對(duì)刀鱭生長(zhǎng)與死亡均無顯著性影響。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)鍶的濃度與孵化率有顯著的相關(guān)性，但與幼魚的死亡率沒有關(guān)聯(lián)[17-18]。通過對(duì)刀鱭幼魚體長(zhǎng)體質(zhì)量數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)鍶元素標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)影響較小。

3.3 剪鰭標(biāo)記對(duì)刀鱭幼魚死亡率的影響

魚鰭有強(qiáng)大的再生能力，剪鰭標(biāo)記具有簡(jiǎn)易便行、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是剪鰭標(biāo)記仍舊會(huì)有損傷魚體，而且保存率較低的缺點(diǎn)[19]。刀鱭幼魚有著較快的生長(zhǎng)速度，平均每天生長(zhǎng)1 mm 左右[20]，因此在標(biāo)記中應(yīng)盡量保持剪鰭后剩余鰭長(zhǎng)一致，避免由于鰭長(zhǎng)所導(dǎo)致的生長(zhǎng)差距，同時(shí)剪一側(cè)胸鰭會(huì)導(dǎo)致魚類在水中游動(dòng)時(shí)會(huì)無法掌握平衡，對(duì)魚的生長(zhǎng)存活有著較大的影響[21]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，剪鰭后2 h 各組間存活率存在顯著性差異（P＜0.05）；其余時(shí)段則差異不顯著（P＞0.05），各組存活率為對(duì)照組（99%）＞剪尾鰭（25.85%）＞剪右側(cè)腹鰭（15%）＞剪右側(cè)胸鰭（8.33%）。就存活率而言，體外標(biāo)記中剪尾鰭是相對(duì)適宜的方法，但張春光等[22]研究顯示刀鱭由于外部原因造成的斷尾再生尾鰭異常現(xiàn)象大量存在，這對(duì)刀鱭幼魚剪尾鰭標(biāo)記效果會(huì)產(chǎn)生一定影響。

4 結(jié)論

ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)有著較高的死亡率，該實(shí)驗(yàn)的不足之處是沒有對(duì)耳石標(biāo)記效果進(jìn)行檢驗(yàn)，無法判斷在30 mg·L-1浸泡濃度下的標(biāo)記效果，后續(xù)將進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)來探究該濃度下的標(biāo)記效果，從而判斷是否進(jìn)行更低濃度的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。剪鰭標(biāo)記作為體外標(biāo)記對(duì)于刀鱭幼魚有較大的損傷，造成了較高的死亡率，該標(biāo)記方法對(duì)于刀鱭幼魚而言不適用，鍶元素標(biāo)記為刀鱭幼魚最適合的標(biāo)記方法，該方法相較于茜素絡(luò)合物和剪鰭標(biāo)記有較低的死亡率，且對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)幾乎沒有影響。后續(xù)將繼續(xù)開展刀鱭幼魚的耳石鍶標(biāo)記效果檢驗(yàn)，判斷安全濃度下最佳標(biāo)記效果，為今后的增殖放流標(biāo)記方法選擇提供理論支撐。