裴雷，譚風波，裴謙，羅嘉，王志明，陶一明

（1.中南大學湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410011；2.中南大學湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410008；3.湖南省腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長沙 410031）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球一種導致癌癥相關(guān)死亡的疾病[1]。肝臟是CRC 轉(zhuǎn)移的常見部位[2]，大約50% 的CRC 患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移（colorectal cancer liver metastases，CLM），手術(shù)后5 年總生存率約為40%[3]。在CLM 組織病理學檢查中，可以觀察到CLM 和臨近肝組織之間的界面處會出現(xiàn)不同的組織病理學生長模式（histopathological growth patterns，HGP）。肝轉(zhuǎn)移HGP 評估國際共識指南（2017 版）[4]界定了3 種主要亞型：促纖維組織增生型HGP（desmoplastic histopathological growth pattern，DHGP）、替代型HGP（replacement histopathological growth pattern，RHGP）和膨脹型HGP（pushing desmoplastic histopathological growth pattern，PHGP）。新近研究[5]表明，HGP 亞型之間存在相當大的生物學差異。與DHGP 的CLM患者相比，CLM 中存在RHGP 的患者預后較差，可能和肝切除陽性切緣有一定內(nèi)在關(guān)系，容易復發(fā)轉(zhuǎn)移[6]。DHGP 的血管生成特征是腫瘤邊緣腫瘤血管新生，而RHGP 則主要通過血管選定（vessel cooption）。

值得關(guān)注的是，血管選定是腫瘤一種新的血管生成方式，在肝轉(zhuǎn)移腫瘤生長及抵抗治療中發(fā)揮重要功能[7]。然而，在RHGP 中驅(qū)動血管選定的分子病理機制尚不十分清楚[8]。因此，探索血管選定的病理及潛在分子機制，不僅可以拓寬對CLM的認識，也為更好地控制CLM 提供了新的治療靶點。研究[9]報道，細胞運動關(guān)鍵調(diào)控基因WAVE2表達與CLM 的關(guān)系密切相關(guān)。此外，WAVE2 在CLM 組織中的高表達，與CLM 微血管密度有關(guān)。筆者團隊[10]發(fā)現(xiàn)HSC 中WAVE2 的表達與TGF-β1 和YAP1 信號通路的激活相關(guān)。本研究旨在通過CLM組織標本，采用免疫組化和生物信息分析的方法，研究WAVE2 表達與CLM 與RHGP 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

CLM 石蠟組織樣本共104 例，其中僅1 例病理評估為PHGP，因例數(shù)過少未納入本研究。研究共納入2010—2020 年于中南大學湘雅醫(yī)院普通外科行手術(shù)切除的CLM 患者103 例。男63 例，女40 例；右半結(jié)腸癌24 例，左半結(jié)腸癌45 例，直腸癌34 例；術(shù)前接受化療者15 例，接受放療者2 例。本課題研究內(nèi)容已報中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批備案（批件編號：201103768），同意實施。

1.2 HGP病理評估

HGP 病理評估根據(jù)2017 年國際共識指南標準[4]進行：當CLM 腫瘤周圍有纖維化邊緣并且癌細胞和肝細胞之間沒有接觸時，確定為DHGP。在無瘤周纖維化邊緣并且當癌細胞長入肝實質(zhì)并與肝細胞密切接觸時，確定為RHGP。HGP 評估由2 名獨立的病理醫(yī)生完成。

1.3 免疫組化染色和評估

CLM 石蠟切片置入60 ℃烤箱，烤片24 h。用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，然后EDTA 抗原修復液微波爐進行抗原修復10 min，PBS 緩沖液洗滌。其中WAVE2 抗體（貨號ab204376）的工作濃度為1∶500。CD31 抗體（貨號DAKO22C3）工作濃度為1∶500。WAVE2 染色強度按文獻[10]報道計算H 評分計算，以H 評分87.5（cut-off 值）界定WAVE2 的高低表達。腫瘤微血管染色，通過其平均數(shù)量來分析任何棕色染色的內(nèi)皮細胞或與相鄰微血管明顯分離的內(nèi)皮細胞簇。

1.4 Masson染色

CLM 切片脫蠟步驟同上，0.5% 碘酒精作用10 min。水洗后5%硫代硫酸鈉作用5 min，流水沖洗10 min。Weiger 鐵蘇木素染色5 min，流水洗滌。1%鹽酸酒精分化。麗春紅酸性品紅液染色5 min，蒸餾水稍沖洗。1%磷鉬酸水溶液處理5 min，用苯胺綠液復染5 min。1%冰醋酸處理1 min。95%乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固鏡檢。

1.5 生物信息學分析

使用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org）進行腫瘤免疫浸潤的相關(guān)性分析[11]。WAVE2 的表達與COAD 患者中6 種浸潤性免疫細胞（B 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞，樹突狀細胞）之間的關(guān)聯(lián)進行了評估。

1.6 統(tǒng)計學處理

各組間半定量計數(shù)資料比較采用Fisher 精確概率法分析，用GraphPad Prism Version 9.02 軟件分析制圖。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CLM的HGP病理特征分析

CLM 組織切片HE 染色后進行HGP 評估（圖1A），可以觀察到在DHGP 中，纖維增生邊緣（左上）和腫瘤細胞（右下）之間的直接接觸；RHGP 腫瘤細胞（左下）和肝實質(zhì)（右上）之間的直接接觸。Masson 染色顯示，DHGP 比RHGP 具有更多致密的細胞外基質(zhì)（圖1B）。

圖1 兩種HGP病理特征比較 A：組織切片HE染色；B：組織切片Masson染色Figure 1 Comparison of the pathological features between the two types of HGP A: HE staining;B: Masson staining

2.2 CLM的HGP臨床病理特征分析

本組56.3%（58/103）病理檢查確定為DHGP，46.6%（45/103）病理檢查確定為RHGP。103 例CLM 患者臨床病理特征見表1。通過比較分析兩種HGP 亞型與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，RHGP 與肝轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生時間（P=0.023）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.009）明顯有關(guān)。

表1 HGP與CLM患者的臨床特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of HGP with the clinical features of CLM patients [n (%)]

2.3 CLM組織HGP與血管選定特征

CLM 配對組織進行CD31 標記微血管密度（圖2A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本組58 例DHGP 患者中，16 例（27.5%）患者觀察到血管選定；45 例RHGP患者中，17 例（37%）患者觀察到血管選定；兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023）（圖2B）。

圖2 兩組血管選定的比較結(jié)果 A：CD31染色結(jié)果；B：按HGP分層的血管選定表達的患者比例Figure 2 Comparative results of vessel co-option between the two groups A: CD31 staining;B: Pie chart graph by proportion of vessel co-option stratified by HGP

2.4 WAVE2表達與HGP的相關(guān)性

既往研究[12]發(fā)現(xiàn)WAVE2 是調(diào)控細胞遷移運動的潛在關(guān)鍵分子。103 例CLM 患者組織進行了WAVE2 免疫組化染色分析（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本組58 例DHGP 患者中，34 例（58.6%）患者觀察到高表達，24 例（41.4%）患者觀察到低表達；45 例RHGP 患者中，37 例（82.2%）患者觀察到高表達，8 例（17.8%）患者觀察到低表達；兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011）（圖3B）。

圖3 WAVE2表達的免疫組化檢測結(jié)果比較 A：WAVE2染色結(jié)果；B：按HGP分層的WAVE2表達比例Figure 3 Comparative results of WAVE2 expression between the two groups A: WAVE2 staining;B: Pie chart graph by proportion of WAVE2 stratified by HGP

2.5 WAVE2表達與免疫浸潤的相關(guān)性

新的研究[13]證據(jù)表明，WAVE2 在調(diào)節(jié)免疫細胞功能中至關(guān)重要。筆者通過TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫評估COAD 中WAVE2 表達和腫瘤免疫浸潤之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，WAVE2 表達與腫瘤純度無關(guān)，但是WAVE2 表達與B 細胞（r=0.258，P=1.41e-07）、CD4+T 細胞（r=0.467，P=3.67e-23）、CD8+T 細胞（r=0.318，P=5.47e-11）、中性粒細胞（r=0.407，P=2.02e-17）、巨噬細胞（r=0.301，P=6.63e-10）和樹突狀細胞（r=0.438，P=3.01e-20）的腫瘤免疫浸潤水平呈明顯正相關(guān)（圖4），提示W(wǎng)AVE2 可能是腫瘤免疫微環(huán)境的新調(diào)節(jié)因子。

圖4 結(jié)腸癌中WAVE2表達與免疫浸潤的相關(guān)性Figure 4 Correlation between WAVE2 expression and immune infiltration in colorectal cancer

2.6 WAVE2激活的信號傳導分子分析

為初步探討WAVE2 信號傳導及通路可能參與替代型HGP 與血管選定形成的分子機制，根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫中的Pathway 間的相互作用關(guān)系方法分析，結(jié)果表明WAVE2 信號激活下游分子，如Arp2/3 復合物、TIMM50、CTTN、HDAC4、CYFIP1、CDC42、PDGFB、PRKACA 等（圖5）。表明WAVE2信號激活在癌癥進展中極為重要。

圖5 WAVE2相互作用信號分子網(wǎng)絡(luò)分析Figure 5 Molecular network analysis of WAVE2 interaction signaling

2.7 WAVE2信號傳導通路分子的相關(guān)性分析

利用TIMER2.0 研究COAD 中WAVE2 信號通路相關(guān)基因表達相關(guān)性。結(jié)果顯示，WAVE2 基因表達水平與CTTN（r=0.454，P=1.26e-24）、HDAC4（r=0.54，P=5.43e-36）、CYFIP1（r=0.39，P=4.24e-18）、CDC42（r=0.443，P=2.12e-23）、PDGFB（r=0.316，P=4.25e-12）、PRKACA（r=0.363，P=1.05e-15）等下游分子均呈明顯正相關(guān)（圖6）。進一步提示W(wǎng)AVE2 信號通路激活在CLM 過程中起重要作用，可能參與RHGP 與血管選定形成。

圖6 結(jié)腸癌中WAVE2信號傳導分子相關(guān)性分析Figure 6 Correlation analysis of WAVE2 and signaling pathway molecules in colorectal cancer

3 討 論

通過對特定生物標志物檢測，篩選分類患者，對CLM 的病理特征和分子機制深入研究，有助于為患者制定最佳的治療策略。2017 年頒布的肝轉(zhuǎn)移HGP 模式評分國際共識指南[4]提供了簡單易行的預測指標判斷肝轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤生物學行為并指導治療。HGP 在可切除的CLM 的蘇木精和伊紅染色切片上進行評估，是一種可靠的、可重復的和強有力的預后生物標志物。評估CLM 的HGP 對預測預后有重要意義[14]。本研究中，在103 例行手術(shù)切除的CLM 患者中觀察到58 例DHGP 和45 例RHGP，證實了DHGP 和RHGP 為中國患者肝轉(zhuǎn)移瘤的主要生長模式。同時，筆者通過分析生長模式與臨床病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與肝轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生時間和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)?？紤]到術(shù)前化療誘導改變CLM的HGP 的組織病理學變化，化療與促纖維增生性HGP 的增加獨立相關(guān)[15]，由于本研究納入的術(shù)前化療患者僅15 例，本研究未能觀察到化療與HGP的相關(guān)性。這一結(jié)果提示，DHGP 和RHGP 可能具有不同的腫瘤生物學行為及作用機制。

眾所周知，血管生成在CLM 發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。盡管誘導新生血管生成的能力長期以來一直被認為是這一目的所必需的。但迄今為止，抗血管生成療法在患者中僅顯示出部分有效的療效。血管選定這一以往被忽視的新的血管化機制，因其在抗血管生成療法抗性中的作用以及在腫瘤休眠和侵襲期間癌細胞的血管周圍定位和遷移模式的報道，受到了新的關(guān)注[16]。新近研究[17]表明，腫瘤細胞可以通過增強遷移運動能力，劫持周圍非惡性組織的已經(jīng)存在的血管形成血管選定，而非新生成血管，促進轉(zhuǎn)移和影響治療反應(yīng)。本研究在103 例CLM 交界組織中觀察到微血管密度與HGP顯著相關(guān)，提示RHGP 和DHGP 存在血管選定差異。DHGP 通過血管生成機制，對抗血管生成藥物有反應(yīng)，與之不同的是，RHGP 則通過血管選定機制，并且對抗血管生成藥物治療不敏感。這表明血管選定可能是對抗血管生成療法重要耐藥機制之一。

DHGP 與增加的血管生成能力和細胞毒性T 細胞的浸潤增加有關(guān)，而RHGP 主要通過聯(lián)合預先存在的肝竇血管來建立血管化[18]。此外，在這些腫瘤中觀察到免疫細胞浸潤減少和癌癥運動性增加。當癌細胞竊取血管時可增加它們移動的能力，從而表明，靶向癌細胞的運動，可以用來阻止血管選定。因此，探索這些血管選定的潛在機制，不僅可以拓寬對腫瘤的認識血管生成，也為更好地控制癌癥生長和轉(zhuǎn)移提供了新的治療靶點。為了探討其可能機制，筆者關(guān)注到WAVE2 這一調(diào)控細胞遷移運動的潛在關(guān)鍵分子。WAVE2 已被充分證明與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種人類癌癥的發(fā)病機制有關(guān)[19]。本研究觀察到WAVE2 表達在DHGP 和RHGP 中的存在顯著性差異。生物信息學分析提示W(wǎng)AVE2 表達和結(jié)腸癌中腫瘤浸潤免疫細胞關(guān)聯(lián)。WAVE2 激活CTTN、HDAC4、CYFIP1、CDC42、PDGFB、PRKACA 等下游分子，WAVE2 基因表達水平與其均呈顯著性正相關(guān)。WAVE2 已被證明在小GTPase 和肌動蛋白細胞骨架之間形成關(guān)鍵聯(lián)系。通過激活Arp2/3 復合物，已被證明在CRC 細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[9]。此外，TGF-β1 介導WAVE2 上調(diào)HSC 活化，并在體外和體內(nèi)促進a-HSCs轉(zhuǎn)移，表明存在涉及WAVE2 和YAP1 驅(qū)動CLM 的關(guān)鍵信號通路[10]。WAVE2 還可以通過抑制mTOR的激活，維持T 細胞的平衡，參與調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境[13]。本研究進一步證實WAVE2 調(diào)控細胞遷移運動和參與腫瘤免疫微環(huán)境，并且WAVE2 的高表達促進RHGP 形成。

綜上所述，WAVE2 在CLM 中賦予血管選定和HGP 模式的機制途徑，需要進一步的研究來確定參與這種機制的其他分子。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。