易曉雷 肖 浩 李旭輝 劉志鵬 謝 明

長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院 （長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院）肝膽胰·血管外科，湖南長(zhǎng)沙 410100

肝癌是全球發(fā)病率高、病死率高的惡性腫瘤之一，5年內(nèi)生存率僅為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命性腫瘤[1]。肝癌是一種常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類型，占85%左右，其顯著特點(diǎn)主要為易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差及高病死率[2]。肝切除、肝移植、射頻消融、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞和放射性栓塞術(shù)是目前肝癌治療中常見(jiàn)的方法[3]，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)都已經(jīng)到了中、晚期，錯(cuò)過(guò)了最好的處理時(shí)間，因此大多數(shù)患者的預(yù)后較差[4-5]。第一個(gè)經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）通過(guò)用于治療晚期肝癌的多靶點(diǎn)抗腫瘤一線藥為索拉非尼（sorafenib，SORA）[6]，能通過(guò)對(duì)絲氨酸-蘇氨酸激酶（c-RAF）的抑制，阻斷RAF/MEK/ERK 介導(dǎo)的信號(hào)途徑，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的；有研究表明還可通過(guò)酪氨酸激酶受體的抑制，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR），從而阻止新的腫瘤血管生成，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤新生血管形成的雙重作用[7]。但是大多數(shù)患者在服用SORA 數(shù)月后會(huì)產(chǎn)生對(duì)藥物的抗藥性，目前尚未充分了解其作用機(jī)制，降低藥物耐藥性是改善肝癌治療效果的一個(gè)重要因素。雙芐基異喹啉生物堿—甲基蓮心堿（neferine，Nef）由睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取[8]，研究發(fā)現(xiàn)Nef 具有抗腫瘤作用，而且可以減少腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性。有研究報(bào)道，Nef 對(duì)SGC7901/VCR 的多藥物抗性有明顯的抑制作用[9]。但Nef 在肝癌耐藥中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究通過(guò)觀察Nef 對(duì)耐SORA 肝癌HepG2 細(xì)胞株耐受性的影響，探討其對(duì)人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/SORA 耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制，為Nef 應(yīng)用于肝癌的臨床化療增敏治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/SORA（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑 含胎牛血清（10%）的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、SORA 和Nef 購(gòu)自濟(jì)南精合醫(yī)藥科技有限公司。噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；二甲亞砜（DMSO，濟(jì)南廣宇化工有限公司）；多聚甲醛（南京高和化學(xué)工業(yè)有限責(zé)任公司）40 ng/L；上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司購(gòu)買的磷酸鹽緩沖劑（PBS）；購(gòu)自濟(jì)寧泰華化工科技有限公司的熒光消除劑；末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）反應(yīng)液、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、雙蒸水均于北京酷來(lái)博科技有限公司購(gòu)買；TUNE 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。RIPA 蛋白裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗人Akt 和p-Akt（Ser473）多克隆抗體及β-actin 一抗及二抗（HRP，美國(guó)Abcam 公司）。

1.1.3 主要儀器 TGL16M 臺(tái)式高速離心機(jī)（凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；YCP-400Q 細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（美長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司）；88-55030 光學(xué)顯微鏡（寶視德有限公司）；天諾翔TN-60 熒光倒置顯微鏡（深圳天諾翔網(wǎng)絡(luò)科技有限公司）；賽默飛全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；THT-96G 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（上海凈信實(shí)業(yè)有限公司）；DYCZ-24DN 電泳槽（冠兆儀器旗艦店）；DYCZ-24DN 蛋白凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；Trans-Bloy Turbo 轉(zhuǎn)膜儀（上海艾研生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 首先用含胎牛血清（10%）的DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/SORA進(jìn)行初次的細(xì)胞培養(yǎng)，然后將其放置在5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，且箱內(nèi)溫度控制在37℃左右，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，將細(xì)胞接種于6 孔板中，并隨機(jī)分為4 組：空白對(duì)照組、SORA 組（IC50 濃度）、Nef 組[（5.00±0.57）μmol/L]、SORA[（IC50 濃度）+Nef（5.00±0.57）μmol/L]聯(lián)合組。將對(duì)應(yīng)濃度的藥劑分別添加到不同的培養(yǎng)基中，空白對(duì)照組添加相同體積的培養(yǎng)基。然后進(jìn)行56 h 的細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制作用檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。將細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)，添加0.5% MTT 反應(yīng)溶液后，將細(xì)胞放入5% CO2濃度，且箱內(nèi)溫度控制在37℃左右的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，再進(jìn)行4 h 的培養(yǎng)。棄上清，搖動(dòng)培養(yǎng)10 min 后，各孔加入150 μl 二甲基亞砜，然后用酶標(biāo)記器讀取每個(gè)樣品的孔光吸收率（OD），在570 nm 處。細(xì)胞增殖抑制率=[1-實(shí)驗(yàn)組（Nef 組、SORA 組及聯(lián)用組）OD 值/空白對(duì)照組OD 組]×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 待給藥結(jié)束后，用TUNEL法檢測(cè)不同組間細(xì)胞凋亡指標(biāo)。收集細(xì)胞，將細(xì)胞涂片后自然晾干，再放入40 ng/L 多聚甲醛溶液中，進(jìn)行1 h 左右的浸泡，用PBS 漂洗后，樣本浸泡于3% H2O2中30 min，PBS 漂洗后，將試樣浸泡于PBS中，此處需用含1% Triton-X-100 的PBS 浸泡30 min；然后再進(jìn)行PBS 漂洗，滴入50 μl 的TdT反應(yīng)溶液到樣品中，用遮光法進(jìn)行1 h 的遮光處理；然后用PBS 沖洗，加入50 μl 的染料，在陰涼下進(jìn)行30 min 的處理，然后用DAPI 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染；經(jīng)PBS 清洗后，用熒光消除劑密封，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。在各標(biāo)本中，隨機(jī)挑選3 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各組凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和視野中能看見(jiàn)的總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 Western Blot 法測(cè)定各組p-Akt、Akt 表達(dá) 待各組細(xì)胞給藥結(jié)束后，收集各組細(xì)胞至離心管中，然后將等濃度細(xì)胞裂解液加入各組試管內(nèi)，于4℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)一晚，培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細(xì)胞液，10 000×g，4℃，進(jìn)行10 min 的離心，然后各組上方清液即為細(xì)胞總蛋白，加上樣緩沖液，在沸水中煮5 min。取各組蛋白上樣，進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶于搖床上室溫封閉2 h，PBST 清洗3 次，加一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST 清洗3 次，加二抗溫孵育2 h，曝光。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用SNK-q檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對(duì)HepG2/SORA細(xì)胞凋亡率的影響

SORA 組、Nef 組、SORA+Nef 組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率有明顯差異，空白對(duì)照組的凋亡率低于SORA 組、Nef 組和SORA+Nef 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；而SORA 組、Nef 組和SORA+Nef組比較，SORA+Nef組的凋亡率高于SORA組、Nef組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同藥物對(duì)HepG2/SORA細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 不同藥物對(duì)HepG2/SORA細(xì)胞增殖抑制率的影響

SORA 組、Nef 組、Nef+SORA 聯(lián)合組的增殖抑制率明顯高于空白對(duì)照組（P< 0.05）；與SORA相比，Nef 組和Nef+SORA 聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；SORA+Nef 聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于Nef 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同藥物對(duì)HepG2/SORA細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.3 不同藥物對(duì)HepG2/SORA細(xì)胞p-Akt、Akt和β-actin蛋白表達(dá)影響

Western Blot 法測(cè)定各組p-Akt、Akt 表達(dá)。蛋白印跡結(jié)果表明，SORA 聯(lián)合Nef 能顯著降低p-Akt及Akt 的表達(dá)，而SORA 組中p-Akt 及Akt 的表達(dá)高于空白對(duì)照組及Nef 組。見(jiàn)圖1。

3 討論

多個(gè)信號(hào)途徑和多個(gè)遺傳基因聯(lián)合導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生，在某些方面，化學(xué)療法和靶向藥物能有效地延長(zhǎng)其無(wú)病生存和總體生存時(shí)間，并能改善患者的預(yù)后，但是對(duì)原藥和繼發(fā)藥的抗藥性依然是決定其預(yù)后的主要原因[10]。在這之中，PI3K-Akt 通路是肝癌關(guān)鍵通路，在30%～50%的肝癌患者中，其體內(nèi)這一通路被明顯活化，Akt 活化是影響肝癌生存期較低的一個(gè)重要因子[11]。當(dāng)前，PI3K-Akt通路與肝癌耐藥的相關(guān)性引起廣泛關(guān)注。有研究表明在耐藥細(xì)胞株SORA 持續(xù)作用下激活了PI3K-Akt通路[12]。Nef 是一類雙芐基異喹啉藥物，近年開(kāi)始成為研究腫瘤耐藥的熱點(diǎn)。Qin 等[13]實(shí)驗(yàn)顯示，Nef 可以明顯減少人慢性髓性白血病細(xì)胞株K562/G01對(duì)伊馬替尼的藥物敏感性，這可能與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)素P-gp 的激活密切相關(guān)。Zhou 等[14]也證實(shí)Nef 與高熱作用可使ABC 中Pgp、MDR1 mRNA 含量下降，從而使SGC7901/ADM 多藥耐藥性下降，從而降低SGC7901/ADM 的多藥耐藥水平。另外，MCF-7/ADR對(duì)乳癌的抗藥性也得到了證實(shí)[15]。Nef 能抑制卵巢腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制是活化p38MAPK/JNK通路，抑制mTOR 通路活化，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬[14]。在肺癌A549 細(xì)胞株中，有研究[16]表明Nef 可通過(guò)富集氧自由基、抑制PI3K-Akt/mTOR 而誘導(dǎo)自噬，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)SORA 耐藥細(xì)胞HepG2/SORA 中p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P< 0.05），表明耐藥細(xì)胞中PI3K-Akt 通路被激活。Nef 與SORA 聯(lián)用能顯著降低p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)（P< 0.05），表明該通路已受抑制，提示Nef 與SORA 聯(lián)用可以通過(guò)多靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)耐藥、增強(qiáng)藥物作用敏感性，因此具有潛在應(yīng)用價(jià)值。已有研究發(fā)現(xiàn)在SORA 耐藥的肝癌細(xì)胞中，能通過(guò)抑制Akt 將自噬從細(xì)胞保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳鰴C(jī)制，逆轉(zhuǎn)對(duì)SORA 的獲得性耐藥[17]。本研究也證實(shí)Nef 抑制SORA 獲得性耐藥關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt的磷酸化，抑制PI3K-Akt 通路。提示Nef 與SORA聯(lián)用可能將自噬從細(xì)胞保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳?，為研發(fā)調(diào)控自噬的抗腫瘤藥物提供了新思路，但具體機(jī)制還需要后續(xù)深入探究。綜上所述，本研究結(jié)果提示Nef 能增強(qiáng)SORA 敏感性，有效逆轉(zhuǎn)HepG2/SORA 耐藥細(xì)胞對(duì)SORA 的耐藥，其機(jī)制可能與抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路相關(guān)。因此，進(jìn)一步深入研究對(duì)臨床解決SORA 耐藥問(wèn)題具有重要意義。