孫玉瑩，段 微

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤，北京 100010)

1 卵巢癌的診治現(xiàn)狀

婦科惡性腫瘤中卵巢癌的死亡率最高。由于缺乏有效的篩查和檢測(cè)工具，加之早期缺乏臨床癥狀，70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會(huì)在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。卵巢癌早期診斷治療更有效，預(yù)后也更好，I期卵巢癌5年生存率可達(dá)90%，Ⅱ期卵巢癌5年生存率為70%。但是，大多數(shù)病例直到癌癥擴(kuò)散后才被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致5年生存率不到30%[1]。在卵巢癌不同階段，治療方法主要有卵巢癌減滅手術(shù)、化療、激素或靶向治療，但相當(dāng)一部分卵巢癌手術(shù)看似達(dá)到無(wú)腫瘤細(xì)胞殘存狀態(tài)(R0)，并化療至完全緩解(CR)，實(shí)際上仍存在微小殘留病灶或已出現(xiàn)隱匿性微小轉(zhuǎn)移。如果在卵巢癌早期作出診斷、治療早期預(yù)測(cè)治療療效以及疾病復(fù)發(fā)早期發(fā)現(xiàn)，將大大提高患者生存率，或個(gè)性化制定治療方案。

傳統(tǒng)卵巢癌的診斷篩查方法包括常規(guī)組織活檢、經(jīng)陰道超聲(TVUS)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)以及腫瘤抗原CA125檢測(cè)。影像學(xué)手段能幫助識(shí)別卵巢及其他部位的腫瘤組織，但無(wú)法提供明確的診斷，不能準(zhǔn)確進(jìn)行良、惡性腫瘤的鑒別診斷，且對(duì)于病灶較小的腫瘤組織無(wú)法精準(zhǔn)的檢測(cè)。組織活檢的有創(chuàng)性以及腫瘤組織的異質(zhì)性也阻礙了組織活檢的發(fā)展[2]。目前CA125是卵巢癌的特異性生物標(biāo)記物，也是臨床監(jiān)測(cè)的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。CA125在良性疾病及其他惡性腫瘤中表達(dá)升高，因此特異性有限，因此尋找更可靠的卵巢癌篩查和診療標(biāo)志物尤為迫切。

2 ctDNA的優(yōu)勢(shì)

過去幾十年，越來(lái)越多的研究表明了液體活檢技術(shù)在腫瘤篩查和診療中的應(yīng)用潛力[3]。癌癥是一種與基因組改變相關(guān)的分子疾病，由于基因突變檢測(cè)技術(shù)靈敏度大大提高，血液中循環(huán)的細(xì)胞DNA中可識(shí)別出癌細(xì)胞或癌組織，這就是液體活檢。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所將液體活檢定義為“對(duì)血液樣本進(jìn)行的檢測(cè)，以尋找血液中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞或血液中腫瘤細(xì)胞的DNA片段”。腫瘤患者外周血中的循環(huán)游離DNA(circulating-free DNA，cfDNA)來(lái)自多種細(xì)胞，包括癌細(xì)胞，腫瘤微環(huán)境的其他細(xì)胞，非腫瘤細(xì)胞(如造血干細(xì)胞，肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞)等[4]。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的DNA片段稱為ctDNA。ctDNA除存在于外周血，也存在于其他體液，如腹水、乳汁、淋巴液、腹膜液、腹腔灌洗液、胃液、腦脊液等樣本中。相比于腫瘤組織活檢檢測(cè)，ctDNA作為腫瘤診療的潛在生物標(biāo)記物有以下優(yōu)勢(shì)[1]：(1)微創(chuàng)性。腫瘤組織活檢標(biāo)本的獲取可能存在巨大手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，相比之下，ctDNA檢測(cè)創(chuàng)傷較小。研究指出，在胰腺癌(高達(dá)75%)、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌、胃食管癌和黑色素瘤以及原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(高達(dá)50%)、腎癌、前列腺癌中均檢測(cè)到ctDNA[5]。其中，在高級(jí)別漿液性卵巢癌中，TP53突變率高達(dá)90%，ctDNA檢出率約為75%～100%，具有重要研究?jī)r(jià)值[6],BRCA1/2檢出率為25%，也有一定意義。(2)實(shí)時(shí)性。對(duì)于部分晚期或復(fù)發(fā)患者，很難取到組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，而ctDNA檢測(cè)可實(shí)時(shí)反映患者體內(nèi)的腫瘤突變及腫瘤負(fù)荷，為患者的個(gè)性化診療提供更多機(jī)會(huì)。研究表明，ctDNA的半衰期約為16min至2h，因此ctDNA有望作為腫瘤實(shí)時(shí)狀態(tài)的監(jiān)測(cè)，如血漿ctDNA可預(yù)測(cè)60%的早期直腸癌，且發(fā)現(xiàn)ctDNA數(shù)量與腫瘤體積相關(guān)[1]。(3)無(wú)空間異質(zhì)性。腫瘤是一種異質(zhì)性較高的疾病，只通過部分腫瘤組織的檢測(cè)可能漏檢重要變異信息。ctDNA檢測(cè)能更全面地反映體內(nèi)所有腫瘤病灶(包括原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)的分子異常情況。大量研究顯示，ctDNA用于肺癌的常規(guī)管理，以監(jiān)測(cè)克隆進(jìn)化和識(shí)別使用酪氨酸激酶抑制劑耐藥的患者。隨著ctDNA檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，其在腫瘤的全程診療管理中也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[3]。

3 ctDNA在卵巢癌診治中的應(yīng)用

3.1 ctDNA在卵巢癌早篩早檢中的應(yīng)用 目前在卵巢癌早期診斷中，臨床最常用的是CA125、經(jīng)陰道超聲及其他輔助檢查的聯(lián)合。卵巢癌早期病灶太小,血液中CA125水平并不升高，約有50%的I期卵巢癌患者CA125處于正常水平。且CA125可在其他良性疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎性疾病中升高。部分卵巢癌起源于輸卵管，但由于輸卵管常顯示不清，CA125聯(lián)合TVUS對(duì)早期卵巢癌的檢出率并不高。因此，CA125作為卵巢癌診斷的腫瘤標(biāo)志物缺乏特異性[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，血漿ctDNA具有作為癌癥微創(chuàng)診斷工具的潛力，特別是針對(duì)高級(jí)別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)。TCGA數(shù)據(jù)顯示，約90%的HGSOC患者具有TP53突變。既往研究表明，ctDNA檢測(cè)TP53突變具有>75%的靈敏度和>80%的特異性。也有研究基于ctDNA的拷貝數(shù)變異輔助診斷卵巢癌，相比TP53突變，靈敏度略有下降[8]。除外周血ctDNA檢測(cè)外，近年也有研究指出，腹水也可進(jìn)行ctDNA突變檢測(cè)。Han等選取了10例EOC患者，9例患者的腫瘤組織和腹水ctDNA中均存在體細(xì)胞突變，證實(shí)了這種突變的一致性。因此,血漿ctDNA與CA125聯(lián)合檢測(cè)可提高卵巢癌早期診斷的敏感性,且腹水ctDNA可能比血漿ctDNA更適用于識(shí)別卵巢癌的突變情況并協(xié)助制定治療策略。此外發(fā)現(xiàn)，連續(xù)血漿樣本中提取的ctDNA與EOC進(jìn)展、復(fù)發(fā)時(shí)間相似，比CA125更快[9]。然而，TP53功能性失活突變及拷貝數(shù)變化是多種實(shí)體瘤常見的分子異常事件，當(dāng)TP53突變時(shí)，仍需結(jié)合其他臨床癥狀進(jìn)行卵巢癌的綜合診斷。

近幾年，隨著ctDNA甲基化技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，目前在腫瘤早篩中有較大潛力。2017年Widschwendter等通過對(duì)699例腫瘤患者和非腫瘤患者組織的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物用于區(qū)分腫瘤患者和健康/良性腫瘤患者，靈敏度和特異性分別為41.4%和90.7%。通過化療后ctDNA甲基化狀態(tài)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ctDNA甲基化標(biāo)志物能正確識(shí)別78%的化療響應(yīng)和86%的無(wú)響應(yīng)患者，優(yōu)于CA125(35IU/mL)的監(jiān)測(cè)能力(20%和75%)[10]。2020年Liu等探索了基于cfDNA甲基化特征預(yù)測(cè)多種腫瘤以及進(jìn)行腫瘤溯源的可行性。研究共納入6689例參與者(包含2482例腫瘤患者以及4207例非腫瘤患者)，結(jié)果顯示，驗(yàn)證組中cfDNA甲基化在預(yù)測(cè)12種腫瘤(包含卵巢癌)中的特異性為99.3%，Ⅰ～Ⅲ期腫瘤的靈敏度為67.3%。通過cfDNA甲基化進(jìn)行腫瘤發(fā)生部位溯源準(zhǔn)確率可達(dá)93%，其中進(jìn)行卵巢癌腫瘤溯源在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中的準(zhǔn)確性分別為96%和100%[11]。通過DNA甲基化進(jìn)行腫瘤預(yù)測(cè)后續(xù)有待前瞻性的驗(yàn)證結(jié)果。此外，ctDNA檢測(cè)還可與多種其他生物標(biāo)志物聯(lián)合使用，如CA125、表觀遺傳標(biāo)記物、循環(huán)腫瘤RNA、核小體、外泌體和相關(guān)免疫標(biāo)記物等，從而成為早期癌癥檢測(cè)分析的關(guān)鍵組成部分，而且更適用于目前尚未使用ctDNA篩查的癌癥，如卵巢癌、胰腺癌和胃癌等[6]。綜上，ctDNA是一種可行的卵巢癌診斷性生物標(biāo)志物。

3.2 ctDNA在患者治療中的應(yīng)用 如果能在卵巢癌治療的早期階段預(yù)測(cè)治療療效，患者可選擇更適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，特別是對(duì)化療方案的選擇。因此，ctDNA檢測(cè)方法可能徹底改變現(xiàn)有的卵巢癌管理方案。

3.2.1 ctDNA檢測(cè)指導(dǎo)晚期患者精準(zhǔn)治療 Oikkonen等分析12例高級(jí)別漿液性卵巢癌患者治療前、治療期間和治療后的78個(gè)血漿ctDNA樣本，結(jié)果顯示，ctDNA和腫瘤樣本的突變和拷貝數(shù)改變具有很好的一致性，并在7例患者(58%)中檢測(cè)到與臨床可用藥物相關(guān)的改變,證明可使用ctDNA指導(dǎo)臨床治療。此外，該研究結(jié)果還顯示,縱向ctDNA樣本可用于識(shí)別第一個(gè)化療周期后反應(yīng)較差的患者。因此縱向ctDNA取樣可用于監(jiān)測(cè)對(duì)一線治療的反應(yīng)，并識(shí)別HGSOC中反應(yīng)不良的患者[12]。Noguchi等[13]研究中，檢測(cè)了51例不同組織學(xué)類型卵巢癌患者血漿中的ctDNA基因突變譜，發(fā)現(xiàn)94%患者有一個(gè)或多個(gè)非同義體細(xì)胞突變，其中最常見的是高級(jí)別漿液性卵巢癌患者中的TP53基因突變。分析ctDNA與臨床病理類型及預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，ctDNA濃度較高時(shí)，患者的無(wú)進(jìn)展生存期較差；使用ctDNA可識(shí)別個(gè)體卵巢癌患者的臨床基因組圖譜，可作為一個(gè)有用的預(yù)后指標(biāo)，因此基于ctDNA的基因圖譜可能有助于制定個(gè)性化的治療策略。此外，還有研究[14]收集了44例婦科癌癥患者在手術(shù)期間和整個(gè)治療過程中的腫瘤組織和血清樣本(包括22例卵巢癌，17例子宮體癌，1例腹膜癌，3例輸卵管癌，1例同時(shí)存在輸卵管癌和子宮癌)，其中93.8%的患者檢測(cè)到ctDNA，且ctDNA水平與血清CA125和CT掃描結(jié)果高度相關(guān)。相關(guān)研究[15]選取了105例卵巢、子宮、宮頸、外陰陰道和不明的婦科原發(fā)性腫瘤患者的血漿和組織，通過實(shí)驗(yàn)分析得出結(jié)論，較高的ctDNA最大突變等位基因頻率與總生存率較差相關(guān)，與ctDNA改變相匹配的治療與改善的總生存率獨(dú)立相關(guān)。組織和ctDNA基因組結(jié)果有較高的一致性(其中大多數(shù)卵巢癌和子宮癌86%為高級(jí)別；34%的卵巢癌有BRCA改變，22%為鉑敏感)。以上研究均顯示了組織和ctDNA基因組結(jié)果有較高的一致性。因此ctDNA檢測(cè)可應(yīng)用于婦科癌癥患者的預(yù)后和個(gè)體化治療中。此外，研究還表明，在婦科癌癥中應(yīng)用ctDNA相對(duì)于目前使用的血清和影像學(xué)檢查，更能動(dòng)態(tài)地預(yù)測(cè)治療反應(yīng)。

3.2.2 ctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提示卵巢癌治療療效和藥物耐藥機(jī)制與預(yù)后 目前大部分研究均顯示，體細(xì)胞TP53突變是高級(jí)別漿液性卵巢癌的一個(gè)特征性發(fā)現(xiàn)。Kim等[16]研究中，選取61例HGSOC患者的103例腫瘤組織進(jìn)行直接測(cè)序分析，結(jié)果顯示67.2%的患者有TP53突變。并且所有患者的體細(xì)胞突變均發(fā)生在漿細(xì)胞游離DNA。對(duì)診斷為HGSOC和TP53突變的患者，根據(jù)療程隨訪ctDNA、CA125和CT，ctDNA顯示了作為腫瘤特異性治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物的潛力。治療后3個(gè)月的TP53突變的患者ctDNA水平比CA125具有顯著的預(yù)測(cè)效果。此外，PIK3CA和KRAS已被證實(shí)是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中最常見的突變基因[17]，它們的突變已被識(shí)別出來(lái)，可進(jìn)行高度敏感分析。上述研究篩選了306例患有PIK3CA或KRAS體細(xì)胞突變的卵巢癌患者。其中85例EOC患者存在體細(xì)胞PIK3CA和(或)KRAS突變，隨后使用血漿中的液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)分析相應(yīng)的突變。ctDNA在EOC患者中的檢出率為27%。其中晚期患者和腹膜細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性患者ctDNA檢測(cè)頻率較高。因此ctDNA檢測(cè)被認(rèn)為是預(yù)后指標(biāo)，多因素分析顯示ctDNA也是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究還評(píng)估了17例患者術(shù)前和復(fù)發(fā)時(shí)匹配血漿中的突變頻率，發(fā)現(xiàn)6例患者復(fù)發(fā)時(shí)的細(xì)胞游離DNA突變率高于初級(jí)診斷時(shí)的突變率。因此ctDNA升高可能是監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的一個(gè)指標(biāo)，這表明即使診斷時(shí)腫瘤是局部的，也可能發(fā)生腫瘤擴(kuò)散[17]。

目前，PARPi用于治療BRCA1/2突變以及HRD的卵巢癌患者已進(jìn)入卵巢癌臨床標(biāo)準(zhǔn)治療路徑，然而，盡管PARP抑制劑可顯著提高晚期卵巢癌患者的生存期，但是部分患者仍不可避免地進(jìn)展為耐藥性患者。越來(lái)越多的PARP抑制劑的耐藥機(jī)制也相繼報(bào)道。通過ctDNA的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)也可探索卵巢癌PARPi的潛在耐藥機(jī)制。2019年ARIEL2隨訪研究中通過ctDNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)具有BRCA1/2突變的患者在PARP抑制劑治療前和進(jìn)展后進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18%的鉑難治患者和13%的鉑耐藥患者具有BRCA回復(fù)突變，而在鉑敏感的患者中僅有1例。經(jīng)PARP抑制劑治療后，78例疾病進(jìn)展患者中有8例患者檢出BRCA的回復(fù)突變[18]。通過ctDNA檢測(cè)在乳腺癌和卵巢癌鉑類/PARP抑制劑耐藥的患者中檢出BRCA的回復(fù)突變[19]。因此可通過cfDNA測(cè)序分析檢測(cè)卵巢癌PARP抑制劑或鉑耐藥患者的突變。

3.3 ctDNA在卵巢癌治療反應(yīng)中的預(yù)測(cè)作用 在卵巢癌治療前，檢測(cè)ctDNA將有助于早期發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)患者的分期做出適當(dāng)?shù)闹委煛Ｔ谥委熯^程中，定期監(jiān)測(cè)ctDNA可闡明從基因改變獲得的耐藥性，這是現(xiàn)在常規(guī)方法檢測(cè)不到的。此外，ctDNA還可檢測(cè)殘留病灶，有助于預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，基于ctDNA的藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)可打開卵巢癌治療的新視野[20]。研究表明，ctDNA評(píng)估可能對(duì)預(yù)后和治療都有意義，在婦科癌癥患者中提供個(gè)體化的癌癥治療。較高的ctDNA最大突變等位基因頻率與較差的總生存率相關(guān)，與ctDNA基因組改變相匹配的治療和與ctDNA基因組改變不匹配的治療相比發(fā)現(xiàn)，相匹配的治療總生存率更高。組織和ctDNA基因組結(jié)果顯示出較高的一致性，不受時(shí)間和空間因素的影響。需更多的研究來(lái)更好地定義ctDNA評(píng)估在婦科癌癥治療中的作用[15]。對(duì)于晚期癌癥患者，液體活檢檢測(cè)可用于治療選擇、監(jiān)測(cè)治療效果及在耐藥性發(fā)展時(shí)確定最合適的后續(xù)治療。

3.4 ctDNA作為MRD(微小殘留病灶)生物標(biāo)志物的應(yīng)用 原發(fā)腫瘤治療，可通過檢測(cè)到的微轉(zhuǎn)移性疾病來(lái)提高生存率。相當(dāng)一部分看似治療成功的卵巢癌患者，其實(shí)存在隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留病灶，并在初始治療后持續(xù)存在，作為隨后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在來(lái)源。研究顯示，ctDNA檢測(cè)可用于監(jiān)測(cè)MRD，從而幫助評(píng)價(jià)藥物，有效消除或控制初次治療后存在的隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留病灶，從而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[21]。多項(xiàng)回顧性研究表明，ctDNA可在臨床癥狀或現(xiàn)有輔助檢查證據(jù)出現(xiàn)之前識(shí)別殘留疾病患者，用于預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，且具有較高的敏感性和特異性[22]。Elena Pereira等研究顯示，13.7%的患者中，即使CT掃描陰性，ctDNA也能檢測(cè)到微小癌灶的存在，平均預(yù)測(cè)領(lǐng)先時(shí)間為7個(gè)月，明顯高于CT成像。且在最初治療6個(gè)月后，ctDNA檢測(cè)水平與無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期顯著改善相關(guān)。上述研究均表明了在婦科癌癥中應(yīng)用ctDNA可識(shí)別殘余腫瘤。將腫瘤組織活檢、臨床輔助檢查與基于ctDNA檢測(cè)的液體活檢結(jié)合起來(lái)，用于指導(dǎo)臨床治療和改善患者預(yù)后。通過高度精確的ctDNA檢測(cè)和定量方法，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行非侵入性的監(jiān)測(cè)，能比現(xiàn)有臨床監(jiān)測(cè)更早地檢測(cè)到殘余疾病，且腫瘤的體積、代謝和增殖率均與血漿中ctDNA數(shù)量正相關(guān)，以及基于腫瘤基因組景觀進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估和個(gè)性化治療來(lái)改變臨床預(yù)后[23]。研究發(fā)現(xiàn)，體液中ctDNA檢測(cè)也有作為癌癥治療后檢測(cè)殘余病灶的潛力。最終，將MRD的ctDNA分析應(yīng)用到臨床工作中，指導(dǎo)個(gè)體化治療和改善化療患者預(yù)后[23]。

4 ctDNA檢測(cè)在卵巢癌中面臨的挑戰(zhàn)

液體活檢ctDNA越來(lái)越多地被應(yīng)用于腫瘤學(xué)中，然而，它們的使用僅限于臨床研究。因此需在應(yīng)用于臨床之前對(duì)液體活檢進(jìn)行更多的臨床前研究。目前大量研究顯示，大多數(shù)液體活檢檢測(cè)缺乏臨床有效性的證據(jù)，特別是在臨床應(yīng)用方面?，F(xiàn)在大多數(shù)分析方法集中于血漿這單一分析物上，但通過采用多參數(shù)分析方法，結(jié)合來(lái)自血液樣本中存在的多個(gè)分析物的數(shù)據(jù)，可以提高分辨率。此外，還可通過腹水、腹腔沖洗液、初次活檢組織中的分析物，共同提高分辨率。未來(lái)液體活檢的發(fā)展預(yù)計(jì)將覆蓋一系列學(xué)科，包括基礎(chǔ)生物學(xué)和生理學(xué)、分子生物學(xué)和分析技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)等。最重要的是，分析開發(fā)人員必須要遵循監(jiān)管指導(dǎo)來(lái)建立分析性能和分析有效性。只有在臨床有效性和臨床效用被證明之后，液體活檢才能充分發(fā)揮其潛力，并對(duì)卵巢癌患者的臨床管理產(chǎn)生預(yù)期的影響[24]。

5 結(jié)論

目前，找到有效的卵巢癌早期檢測(cè)工具仍是診斷和治療卵巢癌疾病中最重要的環(huán)節(jié)之一?，F(xiàn)在ctDNA主要作為輔助檢測(cè)，并不能取代金標(biāo)準(zhǔn)組織活檢。早期診斷卵巢癌以及評(píng)價(jià)卵巢癌的治療反應(yīng)、指導(dǎo)用藥，將大大改善患者的預(yù)后，提高生存率。ctDNA有望成為癌癥篩查、診斷、預(yù)后評(píng)估、藥物反應(yīng)監(jiān)測(cè)和疾病監(jiān)測(cè)的重要臨床工具。但ctDNA早期疾病檢測(cè)的準(zhǔn)確性、高實(shí)施成本、克隆造血的混淆有待進(jìn)一步臨床實(shí)用研究。