龍英霞，史云芳，孟凡榮，翟春雅，李 娜，張 穎，王秋霞，馬艷紅，袁碧波，李曉洲

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市女性生殖健康與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300052)

我國是出生缺陷大國，產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷是降低新生兒出生缺陷的主要手段[1]。血清學(xué)篩查仍是我國大部分地區(qū)一線產(chǎn)前篩查方法，但陽性預(yù)測值低，假陽性率高[2-4]。目前產(chǎn)期診斷方法主要包括絨毛穿刺、羊膜腔穿刺和臍靜脈穿刺[1]，這些檢查均屬于有創(chuàng)操作，技術(shù)復(fù)雜，細(xì)胞培養(yǎng)周期長，同時會增加流產(chǎn)及宮內(nèi)感染等風(fēng)險。因此，需一種更準(zhǔn)確、快速、無創(chuàng)、簡便的篩查方法，減少不必要的產(chǎn)前診斷。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)是利用高通量測序技術(shù)檢測母體血漿中游離的胎兒DNA，從而發(fā)現(xiàn)常見染色體非整倍體高風(fēng)險胎兒。與血清學(xué)篩查相比，NIPT具有更高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性[5-6]。在發(fā)達(dá)國家，NIPT已成為產(chǎn)前篩查的首選方案[7-8]，但其對產(chǎn)前診斷效能的影響鮮有報道。本研究通過分析NIPT開展前、后產(chǎn)前診斷資料，探討NIPT在染色體核型分析中的應(yīng)用價值，為NIPT作為一線篩查方法提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取NIPT開展前(2013年10月至2015年9月)、NIPT開展后(2017年10月至2019年9月)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心行羊膜腔穿刺的孕婦(孕19～24周)。NIPT開展前，我院總分娩數(shù)9404例，其中2275例(24.18%)需行產(chǎn)前診斷；NIPT開展后，我院總分娩數(shù)8464例，其中357例(4.22%)需行產(chǎn)前診斷。羊水染色體檢測孕周19～24周，有產(chǎn)前診斷指征的孕婦均進(jìn)行遺傳咨詢，在知情選擇的情況下，自愿簽署知情同意書。

1.2 NIPT檢測方法 抽取孕婦靜脈血5mL，4℃條件下6h內(nèi)提取血漿中胎兒游離DNA，采用Nextseq CN500基因檢測儀以及染色體非整倍體(T21、T18、T13)基因測試試劑盒(北京貝瑞和康公司)進(jìn)行全基因大規(guī)模平行測序。讀取的序列數(shù)據(jù)通過生物信息軟件分析，獲得染色體數(shù)目評價結(jié)果。根據(jù)Z值進(jìn)行結(jié)果判讀，Z值參考范圍-3～3。

1.3 染色體核型分析方法 孕婦在B超引導(dǎo)下，經(jīng)腹羊膜腔穿刺，抽取羊水20mL，離心棄上清。將羊水細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況后更換培養(yǎng)液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)2～3d。收獲3h前向培養(yǎng)基中加50μL/mL秋水仙素，按本室常規(guī)方法制片、G顯帶，染色體自動掃描分析系統(tǒng)下計(jì)數(shù)20個分裂相，選擇2～5個分裂相進(jìn)行染色體核型分析，如遇到嵌合體情況，則加數(shù)至50個分裂相。

1.4 結(jié)果判讀 根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(International System for Human Cytogenomic Nomenclature,ISCN)2020版的規(guī)范命名。

1.5 觀察隨訪 對所有孕婦進(jìn)行隨訪，追蹤其妊娠結(jié)局：染色體異常終止妊娠者觀察胎兒表型；染色體正常者于天津市婦幼系統(tǒng)及電話隨訪至產(chǎn)后1年。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)、率和構(gòu)成比來表示。陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)。不同組別率的比較采用卡方檢驗(yàn)或校正的卡方檢驗(yàn)，P=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 NIPT開展前后各產(chǎn)前診斷指征對染色體異常的預(yù)測效能 NIPT開展前，行產(chǎn)前診斷2275例(24.18%)，共檢出染色體異常73例，所有產(chǎn)前診斷指征對染色體異常的總效能為3.21%(73/2275)。各類產(chǎn)前診斷指征中，夫婦一方染色體異常的預(yù)測效能最高(72.73%)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險和單純高齡的陽性預(yù)測值分別為2.94%和2.56%，其余指征均未發(fā)現(xiàn)異常染色體。具體染色體異常檢出情況見表1。

表1 NIPT開展前產(chǎn)前診斷指征對染色體異常的預(yù)測效能

NIPT開展后，行產(chǎn)前診斷357例(4.22%)，共檢出染色體異常140例，所有產(chǎn)前診斷指征的總效能為39.22%(140/357)。各類產(chǎn)前診斷指征中，NIPT高風(fēng)險的陽性預(yù)測值為48.36%，僅次于夫婦一方染色體異常的陽性預(yù)測值(56.67%)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險和超聲軟指標(biāo)異常的陽性預(yù)測值分別為14.29%和11.76%，其余指征均未發(fā)現(xiàn)異常染色體。具體染色體異常檢出情況見表2。NIPT開展后羊水染色體核型異常檢出率為39.22%，顯著高于開展前(3.21%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表2 NIPT開展后產(chǎn)前診斷指征對染色體異常的預(yù)測效能

*羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗1例；a染色體異常遺傳自親代

2.2 NIPT開展前后產(chǎn)前診斷指征的構(gòu)成 NIPT開展前2275例行羊膜腔穿刺病例中，血清學(xué)篩查高風(fēng)險約占95.56%，其余產(chǎn)前診斷指征構(gòu)成比由高到低依次為單純高齡、染色體患兒妊娠史、夫婦一方染色體異常、超聲軟指標(biāo)異常及其他因素(包括親子鑒定、懷疑胎兒病毒感染等)。

NIPT開展后357例行侵入性產(chǎn)前診斷病例中，NIPT高風(fēng)險約占68.35%，血清學(xué)篩查高風(fēng)險占1.96%，僅高于因其他因素行羊膜腔穿刺的病例數(shù)；其余產(chǎn)前診斷指征構(gòu)成比由高到低依次為超聲軟指標(biāo)異常、夫婦一方染色體異常、染色體患兒妊娠史、單純高齡、單基因病家族史。具體產(chǎn)前診斷指征分布見表3。

表3 NIPT開展前、后產(chǎn)前診斷指征的構(gòu)成

2.3 隨訪結(jié)果 羊水染色體核型分析提示染色體數(shù)目異常和染色體非平衡結(jié)構(gòu)重排的孕婦均終止妊娠，觀察到胎兒表型與染色體異常相符；其它染色體平衡結(jié)構(gòu)改變及陰性結(jié)果于天津市婦幼系統(tǒng)及電話隨訪至產(chǎn)后1年，未見異常表型及生長發(fā)育遲緩。

3 討 論

我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，其中最常見的因素是染色體異常[9-10]。染色體異?；純旱念A(yù)后差，缺乏有效的治療手段，給家庭及社會帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[11]。染色體核型分析是診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但我國是一個人口大國，產(chǎn)前診斷資源有限，難以滿足臨床需求。因此，高效、準(zhǔn)確的篩查方法尤為重要。NIPT具有很高的靈敏度和特異性,正逐漸成為國外產(chǎn)前篩查的首選方法[12-13]，其對產(chǎn)前診斷的效能影響也是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。

血清學(xué)篩查作為我國一線篩查方案，以其作為產(chǎn)前診斷指征，陽性預(yù)測值僅3%～5%[2-4]。本中心數(shù)據(jù)顯示，NIPT開展前以血清學(xué)篩查為產(chǎn)前診斷指征占95.56%，但陽性檢出率僅為2.94%，大多數(shù)血清學(xué)篩查的孕婦被高風(fēng)險，增加羊膜腔穿刺數(shù)量的同時降低了產(chǎn)前診斷的效能，與其他研究結(jié)果一致[14]。天津市政府在“國衛(wèi)辦婦幼發(fā)[2016]45號文件”基礎(chǔ)上[15]提出NIPT慎用人群在充分告知并知情同意的前提下可自愿申請NIPT檢測，NIPT高風(fēng)險再進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷。因此，許多孕婦直接選擇NIPT或二者聯(lián)合篩查，因血清學(xué)高風(fēng)險行產(chǎn)前診斷的占比大幅度下降，僅占1.96%。一些發(fā)達(dá)國家已將NIPT作為一線產(chǎn)前篩查方法，但在我國NIPT仍為二線產(chǎn)前篩查，原因在于價格昂貴。有研究指出，若將NIPT的價格降到60.50美元，其作為一線篩查的成本-收益會高于血清學(xué)篩查[16-18]。因此，2019年天津市政府將NIPT納入惠民政策，免費(fèi)為本市戶籍孕產(chǎn)婦進(jìn)行檢測。

NIPT的開展不僅減少不必要的產(chǎn)前診斷，還能提高產(chǎn)前診斷的效能。國外一些研究發(fā)現(xiàn)，NIPT的應(yīng)用使產(chǎn)前診斷數(shù)量下降約40%[14,19-20]。本研究數(shù)據(jù)顯示，NIPT開展后產(chǎn)前診斷由24.18%(2275例)降至4.22%(357例)，產(chǎn)前診斷數(shù)量下降了84.31%，高于既往的研究數(shù)據(jù)。但是目前國內(nèi)外的研究并未提供NIPT在產(chǎn)前診斷中效能良好的證據(jù)。本研究中，NIPT開展后染色體核型分析的效能(39.22%)顯著高于開展前(3.21%)。值得注意的是，本研究NIPT開展前后各產(chǎn)前診斷指征中夫婦一方染色異常孕婦的胎兒染色體異常檢出率均最高，且胎兒染色體異常均為親源性。NIPT只是篩查方法，不能代替產(chǎn)前診斷。對于夫婦一方染色體異常，應(yīng)充分告知患者及家屬相關(guān)風(fēng)險，建議首選介入性產(chǎn)前診斷。本研究不足之處在于隨訪年限僅1年，只能觀察到早期表現(xiàn)出來的異常表型和生長發(fā)育障礙，故后續(xù)研究應(yīng)考慮增加隨訪時限。

綜上所述，在產(chǎn)前遺傳咨詢中，必須強(qiáng)調(diào)NIPT僅是篩查手段，臨床醫(yī)生仍需根據(jù)孕婦具體情況提供適當(dāng)選擇，有針對性地建議哪些情況需要行產(chǎn)前診斷。本研究發(fā)現(xiàn)，天津地區(qū)擴(kuò)大NIPT的應(yīng)用范圍在提高羊水染色體核型分析效能的同時減少了產(chǎn)前診斷的數(shù)量，尤其是因血清學(xué)高風(fēng)險行產(chǎn)前診斷的孕婦數(shù)量明顯下降。建議在政府主導(dǎo)及政策法規(guī)的支持下，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)將NIPT作為血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險、高齡、輔助生殖技術(shù)等慎用人群的一線篩查方法。