陳遠(yuǎn)洋 陳曉珊 周全紅

傷口愈合是一個(gè)由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子精密調(diào)控的過(guò)程，該過(guò)程包括四個(gè)連續(xù)且重疊的階段：止血階段、防御/炎癥階段、增殖階段以及成熟階段[1,2]。有效的愈合需要細(xì)胞及細(xì)胞因子有序地發(fā)揮作用，而干擾因素，如機(jī)體持續(xù)的炎癥狀態(tài)、免疫系統(tǒng)紊亂等，會(huì)使愈合過(guò)程中炎癥階段的啟動(dòng)或過(guò)渡受阻，導(dǎo)致病理性傷口的產(chǎn)生[3～5]。病理性傷口會(huì)加重患者的病情，降低患者生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6,7]。

良好的傷口愈合建立在傷口環(huán)境的穩(wěn)態(tài)之上，而炎癥的平衡對(duì)其穩(wěn)態(tài)的維持尤為重要[4,5]。巨噬細(xì)胞對(duì)傷口愈合炎癥階段的始動(dòng)和消解有重要意義，傷口愈合炎癥期，巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS、IL-6等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)生；傷口愈合增殖階段，巨噬細(xì)胞分泌IL-10、VEGF等細(xì)胞因子，緩解炎癥并促進(jìn)組織修復(fù)[4]。

成纖維細(xì)胞參與傷口愈合的關(guān)鍵過(guò)程，如分解纖維蛋白凝塊、產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)等。具有遷移能力的成纖維細(xì)胞是傷口愈合順利進(jìn)行和皮膚結(jié)構(gòu)完整性的重要保證[8,9]。

地塞米松以其在圍術(shù)期抗炎、鎮(zhèn)痛、減少術(shù)中惡心和嘔吐的發(fā)生率等多種優(yōu)勢(shì)被廣泛使用[11]。但關(guān)于地塞米松對(duì)持續(xù)炎癥中傷口愈合的影響及機(jī)制鮮見(jiàn)研究。本研究擬采用Raw264.7-L929共培養(yǎng)體系，聚焦炎癥環(huán)境下，同一體系中，地塞米松對(duì)于兩種細(xì)胞主要功能的影響，為地塞米松對(duì)持續(xù)炎癥下傷口愈合的影響提供新的見(jiàn)解與理論證據(jù)。

材料與方法

1.材料與試劑：小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞株、小鼠L929成纖維細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。LPS (O55:B5)與地塞米松均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Transwell共培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁公司。RNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物公司。反轉(zhuǎn)錄試劑與SYBR Green試劑盒購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將小鼠Raw264.7細(xì)胞與小鼠L929細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天換一次液。

3.CCK-8細(xì)胞存活率檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)濃度篩選：收集生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的Raw264.7細(xì)胞與L929細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，分別接種于96孔板中(2×104個(gè)/孔，每孔100μl)，邊緣用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液填充，同時(shí)設(shè)置空白孔(無(wú)細(xì)胞，僅含培養(yǎng)基)、對(duì)照孔(相應(yīng)細(xì)胞，僅含培養(yǎng)基)、實(shí)驗(yàn)孔(含相應(yīng)細(xì)胞、相應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按以下分組處理：(1)CCK-8測(cè)地塞米松對(duì)細(xì)胞存活率的影響：使用10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松處理細(xì)胞24h。(2)CCK-8 測(cè)LPS與地塞米松對(duì)細(xì)胞存活率的影響：濃度為100ng/ml的LPS與不同濃度的地塞米松(0、10-8、10-7、10-6mol/L)共同處理細(xì)胞24h。之后，向每孔加入10μl CCK-8試劑，2h后在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值，每組取3個(gè)復(fù)孔的平均值，存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

4.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：取常規(guī)培養(yǎng)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Raw264.7細(xì)胞和L929細(xì)胞，分別以2×105個(gè)/孔與6×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于Transwell小室和6孔板中，在培養(yǎng)箱中單獨(dú)培養(yǎng)24h后，將常規(guī)培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，并將小室置于6孔板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。

5.實(shí)驗(yàn)分組：基于共培養(yǎng)體系而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)被分為5組：對(duì)照組(用“-”表示)：僅加入無(wú)血清培養(yǎng)基；LPS組：100ng/ml LPS處理24h；DEX組：10-7mol/L地塞米松處理24h；LPS+DEX組：100ng/ml LPS預(yù)處理6h后，100ng/ml LPS與10-7mol/L地塞米松共處理至24h；DEX+LPS組：10-7mol/L地塞米松預(yù)處理6h后，100ng/ml LPS與10-7mol/L地塞米松共處理至24h。

6.反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)：提取各組Raw264.7細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。操作過(guò)程均按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR定量測(cè)試，檢測(cè)各組細(xì)胞中iNOS、IL-6、IL-10 mRNA的表達(dá)。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

本實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[10]，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min； 循環(huán)反應(yīng)：95℃ 5s、60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA的表達(dá)。

7.劃痕實(shí)驗(yàn)：接種L929細(xì)胞于6孔板中，在建立共培養(yǎng)體系之前，用100μl的槍頭垂直劃痕，用顯微鏡拍照記錄0時(shí)刻劃痕處面積，然后將Raw264.7與L929細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。顯微鏡觀察并記錄24h后同一視野下愈合面積，計(jì)算平均愈合率。愈合率(%)=(0時(shí)刻劃痕面積-24h劃痕面積)/0時(shí)刻劃痕面積×100%。

結(jié) 果

1.LPS與地塞米松對(duì)Raw264.7和L929細(xì)胞存活率的影響：所選濃度地塞米松對(duì)Raw264.7 細(xì)胞存活率影響較小，只有在濃度達(dá)10-3mol/L(存活率為68.75%±7.65%)時(shí)，才顯著降低細(xì)胞存活率。而對(duì)于L929細(xì)胞，地塞米松濃度在達(dá)到10-7mol/L(存活率為89.67%±1.14%)后，細(xì)胞存活率開(kāi)始逐步降低。綜合圖1中A、B的結(jié)果選取10-8、10-7和10-6mol/L的地塞米松作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。圖1中C、D，濃度為10-7mol/L的地塞米松與100ng/ml的處理組合在所測(cè)試的濃度中使兩種細(xì)胞的存活率下降最少： Raw264.7，細(xì)胞存活率為98.01%±2.45%； L929，細(xì)胞存活率為92.12%±1.79%。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選取此種組合作為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 脂多糖與不同濃度地塞米松對(duì)RAW264.7和L929細(xì)胞存活率的影響

2.脂多糖與地塞米松對(duì)共培養(yǎng)體系中Raw264.7炎性細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響：與對(duì)照組比較，LPS組中 RAW264.7細(xì)胞表達(dá)的IL-6和iNOS mRNA顯著增加(P均<0.05)，說(shuō)明細(xì)胞炎癥模型建立成功(圖2 中A、B)。LPS+DEX組，與LPS組比較，表達(dá)的促炎性細(xì)胞因子IL-6和iNOS mRNA有所下降(P<0.05，圖2 中A、B)。而DEX+LPS組，促炎性細(xì)胞因子mRNA較LPS+DEX組更高。該結(jié)果顯示，地塞米松對(duì)共培養(yǎng)體系中RAW264.7促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)的影響與加藥次序有關(guān)。另一方面，各組中小鼠RAW264.7細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, 圖2C)。

圖2 LPS與地塞米松對(duì)共培養(yǎng)體系中Raw264.7炎性細(xì)胞因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

3.LPS與地塞米松對(duì)共培養(yǎng)體系中L929細(xì)胞遷移的影響：持續(xù)炎癥下，地塞米松的處理有利于共培養(yǎng)體系中L929 的遷移，其遷移率遠(yuǎn)高于其他各組(P<0.05)。而地塞米松預(yù)處理后，再伴隨發(fā)生的持續(xù)炎癥組中的L929細(xì)胞遷移率低于LPS+DEX組(圖3B,P<0.05)。地塞米松單獨(dú)處理抑制了L929細(xì)胞的遷移，其遷移率明顯低于對(duì)照組(P<0.05,圖3)。

圖3 共培養(yǎng)體系中L929細(xì)胞的遷移情況

討 論

地塞米松因其強(qiáng)效的抗炎作用在圍術(shù)期被廣泛使用，但其在已有全身炎性反應(yīng)的患者中對(duì)傷口愈合的作用和機(jī)制還缺乏相關(guān)研究[11]。在傷口愈合過(guò)程中，巨噬細(xì)胞具有炎癥始動(dòng)和消解炎癥的雙重功能[4]。成纖維細(xì)胞因其產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、修復(fù)組織等功能在傷口愈合的過(guò)程中扮演著不可替代的角色[12,13]。所以在同一體系中研究地塞米松對(duì)這兩種細(xì)胞的影響有利于揭開(kāi)地塞米松在持續(xù)炎癥中對(duì)傷口愈合影響的謎題。

筆者建立了小鼠RAW264.7-L929細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，并采用CCK-8篩選出對(duì)兩種細(xì)胞存活率都影響較小的LPS與地塞米松的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。共培養(yǎng)體系的建立，聚焦了地塞米松對(duì)細(xì)胞主要功能的影響，突出了研究的重點(diǎn)。LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性反應(yīng)作為體外持續(xù)炎性反應(yīng)情況的模擬已被應(yīng)用于諸多國(guó)內(nèi)外研究中，是本研究中細(xì)胞炎癥模型建立的依據(jù)[14～16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著提高RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，這與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致[14,17]。地塞米松可減輕共培養(yǎng)體系中LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，表現(xiàn)在地塞米松降低了RAW264.7細(xì)胞對(duì)促炎性細(xì)胞因子IL-6和iNOS mRNA的表達(dá)[17,18]。而在預(yù)先使用地塞米松處理的細(xì)胞中，炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)則未被有效抑制。結(jié)果提示，地塞米松可能更有利于持續(xù)炎癥狀態(tài)下傷口中炎癥的解決。更令人興奮的是，研究發(fā)現(xiàn)了地塞米松對(duì)炎癥環(huán)境下共培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。當(dāng)?shù)厝姿杉尤胂扔谘装Y發(fā)生時(shí)，其并未表現(xiàn)出對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的影響。

本研究存在以下不足：(1)研究建立的共培養(yǎng)體系考慮到了兩種細(xì)胞的相互影響，并對(duì)所產(chǎn)生的現(xiàn)象進(jìn)行了闡述，但卻未探討這種影響是受何種機(jī)制控制。(2)由于共培養(yǎng)體系始終無(wú)法對(duì)體內(nèi)復(fù)雜的情況做出充分地模擬，研究結(jié)果還需要在動(dòng)物模型上進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證明了地塞米松在持續(xù)炎癥的環(huán)境下有利于炎癥的控制和成纖維細(xì)胞的遷移。而預(yù)先使用的地塞米松，不利于炎癥控制也無(wú)助于成纖維細(xì)胞的遷移。該結(jié)論為地塞米松影響炎癥下傷口愈合過(guò)程的討論提供了細(xì)胞層面上的新思路。而地塞米松對(duì)于持續(xù)炎性反應(yīng)下機(jī)體及傷口愈合的影響可能涉及到其他細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞因子，其機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。