孫劍峰，王占利，康文彪，豆玲，趙雯，高軍軍

（甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046）

甘肅省大多數(shù)基層獸醫(yī)實驗室已經(jīng)具備分子生物學(xué)檢測能力，實驗隊伍人員配置齊全、素質(zhì)高，實驗室建設(shè)合理，市縣級獸醫(yī)實驗室每年省級比對結(jié)果正確符合率超過90%?，F(xiàn)階段PCR試驗已經(jīng)是病原學(xué)檢測的成熟手段，分子生物學(xué)實驗室主要開展實時熒光PCR試驗，普通PCR試驗由于要進(jìn)行電泳等步驟已經(jīng)很少用。近幾年獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室很容易發(fā)生核酸污染[1]，尤其在春秋兩季集中監(jiān)測樣品任務(wù)量特別大的情況下，加上試驗人員水平層次不平，有的分子學(xué)實驗室構(gòu)造不合理，試驗結(jié)束后消毒和廢棄物處理程序不規(guī)范，極易造成污染。實驗室一旦污染及污染后消毒處理不當(dāng)會導(dǎo)致近段時間無法進(jìn)行試驗，尋找污染步驟及祛除污染需要花費大量人力和試劑[2]，因此預(yù)防核酸污染才是關(guān)鍵?，F(xiàn)結(jié)合兩起獸醫(yī)PCR實驗室污染原因查找過程及祛除核酸污染過程，總結(jié)出相應(yīng)污染原因及控制和清除核酸污染的措施。

1 調(diào)查對象及尋找污染原因的方法

調(diào)查對象是一個獸醫(yī)PCR實驗室。尋找污染原因的方法是通過查看每次做的試驗結(jié)果，對發(fā)現(xiàn)有多份陽性的試驗用增設(shè)空白對照驗證是否污染，如果確實污染就要采集可能污染地方樣品，通過比對試驗查找污染原因，比對試驗主要是不同部位樣品比對、試劑比對、人員比對、實驗室比對、儀器比對等，通過相應(yīng)消毒措施后再用試驗驗證核酸污染是否祛除。

2 實驗室構(gòu)造、主要使用儀器和試劑情況

2．1 實驗室構(gòu)造

該獸醫(yī)PCR實驗室有4個單獨分區(qū)，依次是試劑準(zhǔn)備間、樣品處理及提取間、核酸擴增間、電泳間，壓力分別從正壓到負(fù)壓，每個區(qū)之間有傳遞窗，沒有單獨的緩沖間，排風(fēng)系統(tǒng)是中央空調(diào)系統(tǒng)，每間有2個排風(fēng)口，樣品提取間有2個生物安全柜，1個臭氧消毒機。

2．2 主要使用儀器

全自動核酸提取儀（西安天隆，型號：NP968）,3臺熒光PCR儀（ABI 7500，ABI Q5，Agilent）,4臺高速離心機。

2．3 主要使用試劑

天隆核酸提取試劑盒（批號：E0119090321），哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司的ASFV熒光PCR檢測試劑盒（批號：ASFV2021004），F(xiàn)MDV通用型實時熒光RTPCR檢測試劑盒（批號：FMDV20200601P），青島立見的ASFV熒光PCR檢測試劑盒（批號：40222104），蘭獸研FMDV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒（批號：20210909431），青島立見核酸祛除劑（批號：140321906），納克生物科技有限公司PCR核酸質(zhì)粒氣溶膠污染清除劑（批號：2021060500），84消毒液，70%酒精，30%過氧化氫，自配含氯消毒劑。

3 調(diào)查結(jié)果

2021年6月份，該獸醫(yī)PCR實驗室在春季定點檢測試驗中發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒核酸污染，試驗結(jié)果分析過程中發(fā)現(xiàn)ASF陰性對照和部分樣品核酸陽性，經(jīng)過幾次重復(fù)試驗陰性對照為陽性，懷疑實驗室被ASF核酸污染，通過反復(fù)試驗驗證發(fā)現(xiàn)是提取區(qū)移液器和一個生物安全柜臺面被污染。

2021年11月份，該獸醫(yī)PCR實驗室在秋季集中監(jiān)測試驗中發(fā)生口蹄疫病毒核酸染，96孔反應(yīng)板中陰性對照和空白對照都是FMDV核酸檢測陽性，檢測樣品零散陽性和多份可疑，重復(fù)試驗結(jié)果都有弱陽性出現(xiàn)，且結(jié)果對不上，做了人員比對和試劑比對，結(jié)果還是一樣，懷疑實驗室被FMDV核酸污染，通過實驗室比對、試劑比對、儀器比對等發(fā)現(xiàn)提取間環(huán)境被FMDV氣溶膠污染。

4 核酸污染原因排除、祛除核酸污染過程分析及消毒成效驗證

4．1 ASFV核酸污染原因排除、污染祛除與消毒驗證過程

4．1．1 ASFV核酸污染原因排除

在當(dāng)天非洲豬瘟病原學(xué)試驗中，試驗陰性對照有1份陽性和1份可疑，換了試劑進(jìn)行重復(fù)試驗結(jié)果一致，實驗室可能污染了。換了間PCR實驗室和用兩種試劑同時開展試驗，開始設(shè)立4份空白對照和20份環(huán)境樣品（盛有3 ml PBS的5 ml離心管中開蓋靜置12 h在提取間和擴增間），再進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗，24份樣品全為陰性（試驗成立），說明實驗室環(huán)境和試劑沒有污染。接著通過反復(fù)擦拭采集移液槍頭部及內(nèi)部、離心機孔里、96孔離心板孔里、生物安全柜臺面、地面等18份樣品，用2種試劑繼續(xù)在新PCR實驗室進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗，結(jié)果顯示1份移液器樣品和2份生物安全柜臺面樣品ASFV核酸檢測陽性，其余樣品均為陰性；換了提取間另一個生物安全柜（有自己獨立的移液器），重新用全自動核酸提取儀和手動柱式濾膜提取這18份樣品，同時設(shè)立空白對照，18份樣品檢測結(jié)果全為陰性且試驗成立，說明之前HFsafe 1200的生物安全柜臺面及里面的移液器被污染了。

4．1．2 ASFV核酸污染祛除過程

將污染的生物安全柜臺面放置在地上，先用酒精擦拭臺面內(nèi)外，用除銹劑對安全柜生銹地方進(jìn)行擦拭（生銹地方容易吸附核酸），用核酸消除劑對臺面和安全柜各個部位進(jìn)行噴霧消毒[2]，安裝好臺面，配好3%過氧化氫放置在臺面進(jìn)行熏蒸消毒6h（安全柜密封狀態(tài)），用酒精、核酸消除劑該安全柜移液器進(jìn)行拆卸擦洗、噴霧及安裝后高壓滅菌。

4．1．3 消毒驗證過程

用之前非洲豬瘟已知盲樣6份和重新擦拭采集該生物安全柜臺面和所有移液器樣品及提取間環(huán)境樣品共20份，在污染的實驗室進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗，已知盲樣結(jié)果完全正確，19份樣品陰性，1份安全柜臺面樣品可疑，重復(fù)消毒，1周之后重新采樣進(jìn)行重復(fù)試驗結(jié)果全陰性，ASFV核酸污染消除，實驗室恢復(fù)正常工作。

4．2 FMDV核酸污染原因排除、污染祛除與消毒驗證過程

4．2．1 FMDV核酸污染原因排除

在2021年秋季集中監(jiān)測中開展FMDV實時熒光RT-PCR試驗時，擴增后96孔反應(yīng)板中陰性對照和空白對照都是FMDV核酸檢測可疑或陽性，檢測樣品零散陽性和多份可疑，重復(fù)試驗結(jié)果都有弱陽性及可疑出現(xiàn)，且結(jié)果對不上，換了人員和試劑進(jìn)行重復(fù)試驗結(jié)果一致，實驗室可能污染了，馬上停止試驗查找污染原因。首先換了間新的PCR實驗室，用之前的試劑和樣品開展試驗，并設(shè)立2份空白對照，結(jié)果原先樣品全為FMDV核酸陰性且試驗成立；配制PBS后高壓30 min，分裝2ml在離心管（規(guī)格5 ml）中，用無菌棉簽蘸取滅菌蒸餾水在可能污染地方（移液槍尖里外兩面、離心機孔里、96孔離心板孔里、安全柜臺面、地面）涂抹采樣18份和環(huán)境采樣10份（裝有PBS的離心管靜置12h），在新的分子生物學(xué)實驗室進(jìn)行FMDV實時熒光RT-PCR試驗（全自動核酸提取儀提取和用兩種擴增體系），試驗成立（陰陽性對照及空白對照滿足說明書要求），兩種試劑結(jié)果一致（試劑沒有污染），離心機孔里、安全柜臺面、地面出現(xiàn)4份陽性和1份可疑樣品，環(huán)境樣品出現(xiàn)1份陽性和2份可疑樣品，證明實驗室被口蹄疫病毒氣溶膠污染。這次污染比6月份那次嚴(yán)重多了，查找可能污染步驟，懷疑是陽性對照擴增產(chǎn)物沒有處置得當(dāng)，因為該實驗室的擴增產(chǎn)物在體表噴灑84消毒液后放入提取間生物安全垃圾桶中，八連管管蓋如果沒有完全密封，擴增產(chǎn)物就會污染實驗室。

4．2．2 FMDV核酸污染祛除過程

整個PCR實驗室都要徹底清掃消毒，將污染的生物安全柜臺面及角落、離心機各個孔里、實驗室臺面先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除劑噴霧消毒2遍，地面用5%的含氯消毒劑擦拭消毒[3]，提取間生物安全柜用配好3%過氧化氫放置在臺面進(jìn)行熏蒸消毒不少于6 h，并對槍尖盒、槍架、96孔離心管架用5%的含氯消毒劑浸泡消毒，消毒處理提取間所有敞開或用過的耗材，擴增產(chǎn)物用10%的含氯消毒劑浸泡12 h并轉(zhuǎn)移到廢棄物臨時貯存室 ；打開整個PCR實驗室的紫外燈及移動紫外燈照射消毒6 h，紫外消毒結(jié)束后打開臭氧機8 h（保持閉光狀態(tài)即關(guān)燈拉窗簾，等臭氧消毒結(jié)束后2d每天打開空調(diào)系統(tǒng)12 h），1周后重復(fù)上次的消毒。

4．2．3 消毒驗證過程

消毒半個月后重新采樣驗證消毒效果，用口蹄疫已知盲樣5份和重新采集原先CT值比較小的部位樣品及提取間環(huán)境樣品共17份，在消毒過的實驗室進(jìn)行FMDV實時熒光RT-PCR試驗，實驗結(jié)果（陰性對照翹尾），11份樣品陰性，2份離心機和1份地面樣品陽性，3份環(huán)境樣品可疑；每半個月重復(fù)之前步驟一次，1個月后重新采樣15份，用5份盲樣和2份無RNA酶水驗證試驗，15份樣品和2份無RNA酶水全陰性，盲樣和陰陽性對照都正確，PCR實驗室不消毒空置半個月后重新采樣15份進(jìn)行FMDV實時熒光RT-PCR試驗，結(jié)果全為陰性，實驗室核酸污染消除，該實驗室恢復(fù)正常檢測工作。

5 預(yù)防、清除獸醫(yī)PCR實驗室核酸污染的建議

5．1 獸醫(yī)PCR實驗室核酸污染預(yù)防措施的建議

（1）制定科學(xué)嚴(yán)禁的PCR實驗室管理制度。分子生物學(xué)實驗室負(fù)責(zé)人加強操作人員監(jiān)督，劃分職責(zé)，責(zé)任到人，落實制定制度[3]。

（2）改造不合理的PCR實驗室布局。最少3個區(qū)，一般4個區(qū)，依次為配液間、樣品處理及提取間、核酸擴增間、電泳分析間[4]，4個分區(qū)必須相互獨立（包括儀器設(shè)備、抹布、拖把等），如提取間移液器不能從擴增間直接到配夜間，配液間（屬于潔凈區(qū)）要有單獨的衣服和消毒設(shè)施，堅決不能讓陽性樣品進(jìn)入配液區(qū)。

（3）定期開展試驗人員培訓(xùn)。進(jìn)行崗前培訓(xùn)，開展加強PCR試驗人員生物安全意識和試驗規(guī)范操作的培訓(xùn)，嚴(yán)格落實廢棄物處理制度。

（4）PCR試驗規(guī)范操作。一旦污染需要很長時間清除，只有規(guī)范操作，才能更好防止PCR實驗室污染。開展PCR試驗前，先做好試驗準(zhǔn)備，打開通風(fēng)設(shè)備和空調(diào)系統(tǒng)，穿干凈消過毒的試驗服和鞋，戴好一次性口罩、手套、帽子，將試劑盒放置室溫半小時后進(jìn)行試驗。進(jìn)行PCR試驗時，先分體系放置到配夜間-20℃冰箱中，然后進(jìn)行樣品提取擴增，盡可能使用可高壓處理的移液器和一次性帶濾芯的無RNA酶槍尖；組織和全血樣品處理最好在安全柜臺面鋪設(shè)一次性防水臺布，每次離心管開蓋前要離心防止蓋上殘留液體濺出，如果濺在手套和安全柜臺面后立即更換手套和消毒臺面（先用酒精擦拭再用5%含氯消毒劑噴灑消毒）；每次試驗須設(shè)立2份陰性對照，移液器嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，每年對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)維修保養(yǎng)和定期更換生物安全柜的過濾網(wǎng)及空調(diào)過濾器，加模板時最后加陽性對照（先離心再小心開蓋，模板加完后八聯(lián)管蓋一定要蓋緊）。每次試驗結(jié)束后，形成消毒程序，先將生物安全廢液缸里面廢棄試劑耗材倒入生物安全垃圾袋里及時進(jìn)行高壓滅菌處理再轉(zhuǎn)移至臨時貯存室，PCR產(chǎn)物用10%含氯消毒劑浸泡消毒（不高壓處理），將剩余的試劑耗材密封保存，酒精擦拭安全柜臺面后噴核酸消除劑進(jìn)行消毒，擦拭消毒移液器后并定期進(jìn)行高壓滅菌，消毒臺面和試驗地面用5%的含氯消毒劑擦拭兩遍，各個房間的抹布、拖把不能混用，清掃消毒完后打開安全柜和各區(qū)紫外燈照射1 h。

5．2 清除獸醫(yī)PCR實驗室核酸污染的建議

（1）實驗室一旦發(fā)現(xiàn)污染，立即停止試驗，用實驗室比對、試劑比對、樣品比對查找污染原因，找到可能污染重點部位，進(jìn)行重點消毒，如果是核酸氣溶膠污染要關(guān)閉整個實驗室，并進(jìn)行徹底清掃消毒。

（2）嚴(yán)格按消毒程序進(jìn)行操作。整個PCR實驗室進(jìn)行徹底清掃消毒（消毒液現(xiàn)配現(xiàn)用，消毒液嚴(yán)格按比例進(jìn)行配制），將污染部位先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除劑噴霧消毒2遍，試驗地面及死角用5%的含氯消毒劑擦拭兩遍[5]，生物安全柜用配好3%過氧化氫熏蒸消毒不少于6h，打開整個PCR實驗室的紫外燈及移動紫外燈照射消毒不少于6h，紫外消毒結(jié)束后打開臭氧機8h，臭氧消毒結(jié)束后每天打開通風(fēng)系統(tǒng)12h，如此反復(fù)消毒直至核酸污染祛除。

（3）初次消毒驗證污染祛除后，實驗室打開通風(fēng)系統(tǒng)（每天6h）空置半個月后，重新用試驗進(jìn)行驗證合格后再恢復(fù)實驗室正常工作。