聶韡，單承鶯，劉薇，束成杰，馬世宏

（南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京，211111）

隨著人們生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增大以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，過敏性人群快速增長。據(jù)不完全統(tǒng)計，過敏病患已占世界人口五分之二［1］，在全球范圍內(nèi)，自我感覺為過敏性肌膚的人群越來越多，皮膚過敏已經(jīng)成為影響人類健康的社會問題，具有抗敏功效的化妝品日益受到人們的重視，也是學(xué)者們研究的熱點問題。天然抗敏劑從天然植物中提取，在安全性方面遠遠好于其它化學(xué)合成劑，尤其受到學(xué)者和市場的青睞。開發(fā)含有獨特功效的天然抗敏活性物質(zhì)，將其添加到化妝品中，研制天然抗敏化妝品，已成為化妝品產(chǎn)業(yè)發(fā)展最活躍的主題之一。

南酸棗［Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill（Spondias axillaris Roxb.）］為漆樹科（Anacardiaceae）南酸棗屬植物，又名山棗子、五眼果、四眼果、酸棗樹、貨郎果、連麻樹、鼻涕果，是蒙藥習(xí)用藥材，主要應(yīng)用于臨床治療與心臟相關(guān)的疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，南酸棗果實中含有豐富的黃酮、多酚、皂苷、單寧等生物活性成分［3-4］。近年來，對南酸棗的綜合開發(fā)利用主要集中在食品方面，以南酸棗果肉為原料制備南酸棗糕、南酸棗果醬等，市場銷量非常大，而在大量生產(chǎn)南酸棗食品的過程中南酸棗果皮作為廢棄物被大量拋棄，造成南酸棗資源的極大浪費，同時也極其不環(huán)保。為了更加全面綜合地利用南酸棗資源，擴大南酸棗的應(yīng)用范圍，提高南酸棗的附加值；同時也為了發(fā)掘更多的天然抗敏劑，本文選取南酸棗果皮為原料，提取活性組分，并通過體內(nèi)和體外試驗評價了南酸棗果皮提取物的抗過敏活性，以期為其在抗敏化妝品方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 試驗部分

1.1 主要材料、試劑與儀器

南酸棗果皮，由江西省林業(yè)科學(xué)院提供，經(jīng)烘干粉碎后備用。

試劑：十二烷基硫酸鈉、無水乙醇、甘草酸二鉀、透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉、對-二甲氨基苯甲醛、冰乙酸、乙酸鈉結(jié)晶、無水氯化鈣、氫氧化鈉、濃鹽酸、乙酰丙酮、磷酸氫二鈉、氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

茶多酚、蘆丁標(biāo)準品均購自中國藥品生物制品檢定所。撲爾敏購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器：UV2550紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；FA-1004N電子分析天平（上海名橋精密科學(xué)儀器有限公司）；H/T16MM臺式高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；膚色測量儀（芬蘭Delfin Technologies）。

1.2 試驗方法

1.2.1 南酸棗果皮提取物的制備［5-6］

取干燥粉碎后的南酸棗果皮粉末100 g，加入50%乙醇水溶液（料液比1：20 g/mL），以及100 g十二烷基硫酸鈉輔助超聲提取，超聲功率600 W，超聲溫度40℃，超聲時間20 min，提取2次，過濾，合并濾液，濾液減壓回收去除溶劑中的乙醇，得到南酸棗果皮的粗提液。粗提液經(jīng)D101型大孔吸附樹脂純化，先用30%乙醇水溶液洗脫去除水溶性雜質(zhì)后，收集50%濃度的乙醇水洗脫液，洗脫液減壓濃縮后干燥得到南酸棗果皮提取物。

1.2.2 南酸棗果皮提取物的總黃酮含量測定［7］

1.2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱量蘆丁對照品40 mg，置于小燒杯中，加少量無水乙醇溶解，后轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，即得0.8 mg/mL的蘆丁標(biāo)準品溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準曲線的制備

精密量取蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL棕色容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，靜 置5 min，再 加 入10% Al（NO3）3溶 液1.0 mL，靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻后加入70%乙醇定容至刻度，暗處靜置20 min。于510 nm波長下測定吸光度值（A），同時做空白對照試驗，以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，得到回歸方程y=0.4352x-0.0046，R2=0.9931。當(dāng)待測樣品的濃度范圍在0.02～0.12 mg/mL時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.2.3 樣品測定

精密稱取南酸棗果皮提取物50 mg，加入70%乙醇25 mL溶解，搖勻，過濾備用。

1.2.3 南酸棗果皮提取物的透明質(zhì)酸酶抑制活性測定［8］

透明質(zhì)酸酶溶液和透明質(zhì)酸鈉溶液的配制：量取1155 μL冰乙酸稀釋至100 mL，取4.8 mL為A溶液，稱取2.72 g乙酸鈉結(jié)晶加水溶解定容至100 mL，取45.2 mL為B溶液，混合溶液A與B并以水定容至100 mL，制成pH=5.6的醋酸緩沖液；用配制好的醋酸緩沖液作為溶劑配制透明質(zhì)酸酶溶液和透明質(zhì)酸鈉溶液（兩種溶液的最終工作濃度為1250 U/mL和0.5 mg/mL）。

乙酰丙酮溶液的配制：在50 mL碳酸鈉溶液（1.0 mol/L）中加入3.5 mL乙酰丙酮配制而成。

埃爾利希試劑的配制：稱取0.8 g對-二甲氨基苯甲醛溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無水乙醇中配制成埃爾利希試劑。

采用透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗法進行，取0.1 mL 0.25 mmol/L氯化鈣溶液和透明質(zhì)酸酶溶液保溫培養(yǎng)20 min；加入樣品液0.5 mL，繼續(xù)37℃保溫培養(yǎng)20 min；加入0.5 mL透明質(zhì)酸鈉溶液保溫30 min，常溫放置5 min；加入0.1 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置沸水浴中加熱15 min后立即用冰水冷卻5 min；加入埃爾利希試劑1.0 mL并用3.0 mL無水乙醇進行稀釋，放置20 min顯色，用分光光度計測定其吸光度值。透明質(zhì)酸酶抑制率計算公式如下：

其中，A為對照溶液吸光度（用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液），B為對照空白溶液吸光度（用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液），C為試樣溶液吸光度值，D為試樣空白溶液吸光度（用醋酸緩沖溶液代替酶液）。

1.2.4 抗敏精華乳的制備

制備工藝：按照表1的配方比例，將環(huán)戊硅氧烷，辛酸癸酸三甘油酯和生育酚醋酸酯混合，得第一混合物A相；將甘油，1，3-丁二醇，D-泛醇，乙二胺四乙酸二鈉，漢生膠，尿囊素、十六烷基磷酸酯鉀和去離子水在85℃條件下，攪拌均勻，得第二混合物B相；將第一混合物A相倒入第二混合物B相，均質(zhì)，倒入聚丙烯酰胺C相攪拌均勻，冷卻至50℃左右，依次加入南酸棗果皮提取物，香精，二羥基二甲基乙內(nèi)酰脲D相攪拌均勻，靜置，冷卻，灌裝。

表1 抗敏精華乳的配方比例Tab.1 Formula proportion of anti-allergy essence milk

1.2.5 抗敏精華乳的人體抗敏功效評價

1.2.5.1 鎮(zhèn)靜皮膚效果［9］

實驗選擇按GB17149-1997（化妝品皮膚病診斷標(biāo)準及處理原則）診斷無相關(guān)化妝品皮膚病志愿者30名。通過10%十二烷基硫酸鈉溶液貼片（面積：2 cm×2 cm）刺激上臂內(nèi)側(cè)皮膚，在十二烷基硫酸鈉刺激皮膚后，立即涂用抗敏精華乳和空白精華乳30 min后觀察皮膚癥狀。結(jié)果判定依據(jù)見表2。

表2 結(jié)果判斷依據(jù)Tab.2 Basis of result judgment

1.2.5.2 減輕皮膚紅腫效果［10］

實驗選擇按GB17149-1997（化妝品皮膚病診斷標(biāo)準及處理原則）診斷無相關(guān)化妝品皮膚病志愿者30名。采用1.0%的辣椒素刺激皮膚紅腫，在1.0%的辣椒素刺激皮膚后，立即涂用抗敏精華乳和空白精華乳，通過膚色測量儀（Delfin Skincolorcatch）測試30名志愿者皮膚在不同時期的紅斑值E的平均值，計算皮膚紅斑相對消退率，反映皮膚紅腫現(xiàn)象的變化。

其中，初始紅斑值E表示辣椒素刺激皮膚后紅斑值E；測量紅斑值E表示涂用精華乳一定時間后的紅斑值E。

2 結(jié)果與討論

2.1 南酸棗果皮提取物總黃酮含量測定

參照1.2.2中的方法，計算出南酸棗果皮提取物中總黃酮的含量為73%。

2.2 南酸棗果皮提取物體外透明質(zhì)酸酶抑制活性

配制濃度為0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%的南酸棗果皮提取物溶液，按照1.2.3的方法測定透明質(zhì)酸酶抑制活性，以甘草酸二鉀為陽性對照，結(jié)果如圖1所示，南酸棗果皮提取物和甘草酸二鉀對透明質(zhì)酸酶均具有抑制作用，且抑制率隨著樣品濃度的增加隨之上升，在濃度較低時，南酸棗果皮提取物比相同濃度下的陽性對照甘草酸二鉀的透明質(zhì)酸酶抑制率要低；隨著濃度的增加，南酸棗果皮提取物對透明質(zhì)酸酶的抑制作用逐漸接近于甘草酸二鉀，當(dāng)濃度超過5.0%后，南酸棗果皮提取物對透明質(zhì)酸酶的抑制作用甚至高于陽性對照甘草酸二鉀。試驗結(jié)果證明，南酸棗果皮提取物是一種具有顯著抗敏活性的天然植物原料。

圖1 不同濃度南酸棗果皮提取物和甘草酸二鉀對透明質(zhì)酸酶抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of different concentrations of Choerospondias axillaris peel extract and dipotassium glycyrrhizinate on hyaluronidase

2.3 抗敏精華乳的人體抗敏功效分析

2.3.1 鎮(zhèn)靜皮膚的效果分析

由表3可以看出，通過十二烷基硫酸鈉刺激皮膚后，分別涂用3款抗敏精華乳以及空白精華乳，30 min后皮膚不適癥狀的消除率具有顯著區(qū)別。其中涂抹抗敏精華乳I的30名志愿者中有28名皮膚不適的臨床表現(xiàn)完全消失，僅有2名還有微弱紅斑的現(xiàn)象；抗敏精華乳II的試用志愿者中有19名皮膚不適的臨床表現(xiàn)完全消失；抗敏精華乳III的試用志愿者中有13名皮膚不適的臨床表現(xiàn)完全消失；而空白精華乳的試用志愿者中僅有9名皮膚不適的臨床表現(xiàn)完全消失。由試驗結(jié)果可判斷，本發(fā)明制備的含有南酸棗果皮提取物的抗敏精華乳具有顯著的皮膚鎮(zhèn)靜效果，且和南酸棗果皮提取物的添加量呈現(xiàn)正相關(guān)。

表3 不同抗敏精華乳對皮膚刺激的影響Tab.3 Effects of different anti-allergy essence milk on skin irritation

2.3.2 減輕皮膚紅腫的效果分析

由表4可以看出，辣椒素刺激后皮膚會發(fā)生明顯紅腫。涂抹含不同劑量南酸棗果皮提取物的抗敏精華乳后，皮膚的紅腫現(xiàn)象消退明顯，在60 min左右，抗敏精華乳I對皮膚紅斑消退率達到85.9%，抗敏精華乳II對皮膚紅斑消退率達到76.1%，抗敏精華乳III對皮膚紅斑消退率達到59.4%；而作為對照的空白精華乳，其紅腫120 min左右紅斑消退率才達到42.9%。上述數(shù)據(jù)說明含有南酸棗果皮提取物的抗敏精華乳可以有效消除因外界刺激造成的皮膚表面泛紅現(xiàn)象。

表4 不同抗敏精華乳減輕紅腫結(jié)果Tab.4 Results of reducing redness and swelling with different anti-allergy essence milk

3 結(jié)論與展望

本文試驗結(jié)果顯示，當(dāng)南酸棗果皮提取物質(zhì)量濃度為5%時，對透明質(zhì)酸酶的抑制率可達到90%。進一步實驗結(jié)果表明，將南酸棗果皮提取物用作化妝品功效原料，添加1%～5%的南酸棗果皮提取物，即可對皮膚產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)靜效果，亦可有效消除因外界刺激造成的皮膚表面泛紅現(xiàn)象。本文的研究將南酸棗廢棄的果皮再利用，得到的南酸棗果皮提取物可作為潛在的抗敏化妝品原料，極大提高了南酸棗的利用附加值，進一步拓展了南酸棗的應(yīng)用領(lǐng)域。