張勇剛，陳風(fēng)雷，龍慶祥，張鴻飛，何超超，艾復(fù)清,3※

（1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草公司黔南州公司，貴州 黔南 558000；3.貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

煙葉衰老是指其生理活動和功能衰退過程，包含生理生化變化和外部形態(tài)特征變化，是由相關(guān)基因的特異性有序表達(dá)及其環(huán)境因子協(xié)同作用的結(jié)果[1,2]。煙葉烘烤過程也為葉片衰老過程，其中影響較大的為煙葉含水量和烤房濕度[3]。

近年來，有關(guān)煙葉衰老過程的研究已有一些報道，如張小全等[4]研究發(fā)現(xiàn)葉片衰老速度快的品種，淀粉合成、氮素同化代謝較弱而再利用和再轉(zhuǎn)移代謝能力較強；盧素萍等[5]研究發(fā)現(xiàn)紅光處理提高了煙葉中吲哚乙酸（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）的含量以及過氧化氫酶（CAT）的活性，減少過氧化氫（H2O2）、MDA（丙二醛）和脫落酸（ABA）的含量，延緩膜脂過氧化的發(fā)生，從而延緩葉片的衰老進(jìn)程；武云杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)煙葉的衰老期氮代謝與煙葉衰老速度有關(guān)；凌壽軍等[7]研究結(jié)果表明隨著煙葉成熟衰老程度的增加，葉片中的葉綠素含量下降，MDA 積累加快，過氧化物酶（POD）、CAT 的活性下降、質(zhì)膜透性增強；可見前人對煙葉衰老的研究主要集中于品種、光質(zhì)和氮代謝對衰老的影響以及成熟衰老過程中生理生化及酶活性的變化等研究，而對烤煙烘烤過程中變黃濕度與煙葉衰老的生化變化規(guī)律的關(guān)系鮮見報道。因此本實驗通過控制烤房變黃濕度研究從烘烤開始至定色中期煙葉的含水量、SPAD 值（SPAD 值代表葉片葉綠素含量的相對值）、蛋白質(zhì)含量、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化規(guī)律及各指標(biāo)間相關(guān)性，進(jìn)而把握烘烤過程中變黃濕度對煙葉衰老的影響，旨在為煙葉烘烤調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

試驗材料：云煙85 中部葉、氣流上升式密集烤房。

試驗地點：貴州省甕安縣天文鎮(zhèn)平壩村。該區(qū)域平均海拔910m，年平均氣溫14.5 ℃，年降雨量1100 mm。土壤有機質(zhì)15.20g/kg、全氮1.25g/kg、有效磷9.17g/kg、速效鉀160.20 g/kg、pH 6.1；前茬空閑。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗在變黃期兩個關(guān)鍵恒溫點設(shè)置不同干濕差，具體設(shè)置見表1；各處理設(shè)3 次重復(fù)共30 竿，烤房上中下3 層分別放置10 竿。

表1 試驗設(shè)置表Table 1 Test setup table

1.3 實驗要求

1.3.1 成熟度要求 中部煙葉變黃程度達(dá)60%～70%，主脈2/3～3/4 變白，支脈1/2～2/3 變白[8]。

1.3.2 取樣要求 烘烤過程中每6 h 取樣1 次，選取代表性10 片煙葉，其中5 片煙葉通過干鮮重測定含水量，然后將干制樣品粉碎保存用于化學(xué)成分測定；另外5 片煙葉置于 80 ℃冰箱內(nèi)保存用于酶活性測定。

1.4 主要栽培措施

采用漂浮育苗，4月28日移栽，種植密度為16 500 株/hm2，施肥量為純N 105 kg/hm2，N、P2O5、K2O比為1:1.5:3，留葉數(shù)20 片，可采摘葉16 片，其他栽培措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)要求進(jìn)行。

1.5 測定項目與方法

SPAD 值采用SPAD502 葉綠素儀測定[9]；含水量采用稱重法測定、蛋白質(zhì)含量采用H2SO4-H2O2消化法測定、PPO 活性采用鄰苯二酚氧化法測定、SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法測定[10]。

1.6 統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 26.0 軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水量變化規(guī)律

由圖1可知，烘烤開始-定色中期煙葉含水量為慢 快的下降趨勢，T1、T2 和T3 失水速率0～54 h 分別為0.46%/h、0.29%/h 和0.21%/h，而54～120 h 分別為0.57%/h、0.68%/h、0.73%/h；0～120 h 各處理失水量為60.51%～63.86%。說明烘烤過程中變黃濕度影響著煙葉的水分散失速度，干濕差越大煙葉失水速度越快。

圖1 烘烤過程煙葉含水量變化規(guī)律Fig.1 Variation law of tobacco moisture content during curing

2.2 SPAD 值變化規(guī)律

由圖2可知，各處理煙葉SPAD 值變化規(guī)律均呈慢 快 慢的下降趨勢，下降速率0～24h分別為0.21/h、0.23/h 和0.21/h，24～68 h 分別為0.34/h、0.31/h 和0.29/h，68～120 h 分別為0.04/h、0.06/h 和0.08/h；說明干濕差越大葉綠素降解越快，而變黃前期降解慢、變黃中期降解快，其原因為兩個時期煙葉所消耗的代謝物分別為碳水化合物和含氮化合物；變黃后期至定色中期葉綠素降解速度減慢其原因為煙葉的含水量逐漸減少導(dǎo)致煙葉細(xì)胞逐漸死亡，其饑餓代謝逐漸停止。

圖2 烘烤過程煙葉SPAD 值變化規(guī)律Fig.2 Variation law of SPAD value of tobacco leaves during curing

2.3 蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律

由圖3可知，蛋白質(zhì)含量呈由慢到快的下降趨勢；從T1、T2、T3 處理來看，變黃前期降解慢且差異不大；變黃中期-定色中期降解快，干濕差不同導(dǎo)致不同時間段降解速率不同，24～54 h 降解速率分別為0.08%/h、0.06%/h 和0.03%/h，54～120 h 降解速率分別為0.04%/h、0.07%/h 和0.08%/h。可見54 h 前干濕差越大降解越快，過了54 h 后干濕差小的反而快，其原因為54 h 前干濕差大的煙葉失水速率快導(dǎo)致蛋白酶活性受激，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)含量降解；54 h后干濕差小的失水快，蛋白質(zhì)含量降解速率也隨之加快；說明蛋白質(zhì)降解速率受變黃濕度的影響，干濕差越大，蛋白質(zhì)降解越快。

圖3 烘烤過程蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律Fig.3 Variation law of protein content in tobacco leaves during curing

2.4 酶活性變化規(guī)律

2.4.1 PPO活性變化規(guī)律 由圖4可知，PPO從烘烤開始至定色中期其活性變化均呈雙峰曲線，第1、2 峰值分別出現(xiàn)在變黃中、后期；第1 峰值在24 h 后隨著干濕差越大，其活性上升速度越快，峰值提前出現(xiàn)，活性越?。═1、T2、T3 處理酶活性分別為200.53 U/mg prot、205.62 U/mg prot、210.35 U/mg prot），同時酶活性降低越快，其原因與烤房溫度逐漸升高，干濕差逐漸加大煙葉的含水量逐漸減少有關(guān)。第2 峰值變化趨勢與第1峰值相似，至于第2 峰值低于第1 峰值，其原因與此時煙葉的含水量較低有關(guān)。

圖4 烘烤過程煙葉PPO 活性變化規(guī)律Fig.4 Variation law of PPO activity of tobacco leaves during curing

2.4.2 SOD 活性變化規(guī)律 由圖5可知，SOD 烘烤開始至定色中期其活性呈先升后降的單峰曲線，峰值出現(xiàn)在變黃中期；干濕差越大，峰值出現(xiàn)越早，其活性下降也越快，其原因可能與變黃中期膜脂過氧化程度增加、SOD 響應(yīng)抗氧化機理有關(guān)；36 h 后各處理SOD的活性表現(xiàn)為T3>T2>T1，說明隨著干濕差越大，煙葉的含水量下降越快，促使煙葉的生理代謝速度加快，從而導(dǎo)致SOD 的活性下降速度加快。

圖5 烘烤過程煙葉SOD 活性變化規(guī)律Fig.5 Variation law of SOD activity of tobacco leaves during curing

2.5 相關(guān)性分析

由表2可知，除PPO在變黃前 中期與其余各指標(biāo)不相關(guān)、SOD在變黃前期與其余各指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)外，其余時期各項指標(biāo)之間均呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明衰老過程相關(guān)生化指標(biāo)之間互相影響，其中煙葉含水量對SPAD 值、蛋白質(zhì)含量和SOD 活性的影響極為明顯，說明煙葉的衰老進(jìn)程也受其生化指標(biāo)之間的互作影響。

表2 衰老過程生化指標(biāo)之間的相關(guān)性Table 2 Correlation between biochemical indexes in the aging process

續(xù)表

3 討論

煙葉的烘烤過程是煙葉體內(nèi)生理生化的變化過程，其反應(yīng)主要發(fā)生在變黃期，進(jìn)入定色后，反應(yīng)發(fā)生程度逐漸減弱，尤其是定色中期后，反應(yīng)基本趨于停止，因此，本研究時間段為變黃開始至定色中期。從研究結(jié)果看，SPAD 值、PPO 和SOD 活性等變化至定色中期基本趨于穩(wěn)定不變，證明研究從時間上看具有科學(xué)性。

煙葉體內(nèi)的葉綠素、蛋白質(zhì)和MDA 的含量及SOD、POD 和CAT 的活性可反應(yīng)煙葉的衰老狀況[11]。李麗華[12]、武云杰等[13]研究認(rèn)為，煙葉生長過程中葉綠素和蛋白質(zhì)降解越快、MDA的含量越高以及SOD、POD 和CAT 的活性越低的煙葉衰老越快。本研究結(jié)果表明，烘烤前期干濕差越大，葉綠素和蛋白質(zhì)含量降解越快，PPO 和SOD 的活性峰值出現(xiàn)越早，說明烘烤過程煙葉的衰老快慢與濕度有關(guān)，干濕差越大，煙葉衰老速度越快，這與李常軍[14]、王蓮等[15]的研究結(jié)果具有一定的吻合性。煙葉烘烤過程酶活性峰值的提前，可能與干濕差加大導(dǎo)致煙葉體內(nèi)水分適當(dāng)?shù)奶澣庇嘘P(guān)，從而促進(jìn)了代謝的加快，這可能是衰老速度加快的主要原因。

烘烤過程濕度減小，會促使煙葉衰老速度加快而導(dǎo)致煙葉體內(nèi)大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分，其結(jié)果會導(dǎo)致烤后煙葉化學(xué)成分不協(xié)調(diào)；濕度加大，可延緩煙葉衰老，雖然大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化充分，但可能會導(dǎo)致煙葉干物質(zhì)過分消耗，同樣使煙葉體內(nèi)化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，甚至?xí)?dǎo)致PPO活性升高而誘導(dǎo)酶促棕色化反應(yīng)。因此烘烤過程應(yīng)注意合理調(diào)控濕度，從而提高烘烤質(zhì)量。本研究僅針對云煙85 中部葉進(jìn)行研究，結(jié)果僅供參考。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，隨著烘烤變黃期干濕差加大，煙葉失水速率、SPAD 值及蛋白質(zhì)下降速率越快，PPO 和SOD 酶活性越低；除PPO 在變黃前 中期與其余各指標(biāo)不相關(guān)、SOD在變黃前期與其余各指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)外，其余時期各項指標(biāo)之間均呈顯著或極顯著正相關(guān)；烘烤變黃濕度影響煙葉衰老進(jìn)程，濕度小，利于促進(jìn)煙葉衰老；濕度大，則利于延緩煙葉衰老。因此合理調(diào)控烘烤變黃濕度對控制煙葉衰老速度、促進(jìn)煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性有重要作用。