王平,柯甫志,徐建國
(浙江省柑橘研究所,浙江 臺州 318026)
抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)是一類重要的次生代謝產(chǎn)物,其主要作用是作為抗氧化劑和輔酶因子參與氧化還原反應,同時參與表觀遺傳激活[1-2]。AsA是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì),人體自身無法合成,主要從果蔬中攝取。柑橘品種資源豐富,鮮果供應時間長,可滿足周年供應,已成為我國最大、全球第二大的消費水果,是人們?nèi)粘I瞰@取AsA的重要來源[3]。
植物中存在4條AsA生物合成途徑,擬南芥、番茄等植物突變體結(jié)果表明,L-半乳糖途徑是主導途徑[4-6]。GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphorylase,GGP),又名GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GDP-L-galactose transferase,GGT),催化GDP-L-半乳糖和L-半乳糖-1-磷酸之間的轉(zhuǎn)化,被認為是AsA生物合成途徑中的重要控制節(jié)點[7-9]。
GGP基因家族的全基因組鑒定與特點分析已在小麥中報道[10]。截至目前,GGP基因功能在柑橘中的研究僅局限于單個成員研究[3,11],整個GGP基因家族的生物信息學分析還未見報道。本文通過柑橘已公布的全基因組信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析柑橘GGP蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄組表達,為進一步確定柑橘GGP家族基因的功能奠定基礎。
GGP基因家族序列、染色體定位信息來源于Phytozome數(shù)據(jù)庫。
蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析采用在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進行。亞細胞定位分析采用在線軟件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行。
采用在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。
從NCBI數(shù)據(jù)庫里獲取克里曼丁橘GGP基因家族編碼序列起始位點上游2 000 bp的序列,采用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)分析啟動子區(qū)域順式作用元件,預測基因功能。
柑橘GGP基因家族的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自http://citrus.hzau.edu.cn在線數(shù)據(jù)庫。
從Phytozome數(shù)據(jù)庫公布的克里曼丁橘全基因組中鑒定到4個GGP家族成員,分別命名為CsGGP1~CsGGP4。通過染色體定位發(fā)現(xiàn),CsGGP1、CsGGP2、CsGGP3和CsGGP4分別位于9號、1號、6號和2號染色體上,除了CsGGP1外,其他3個成員都是全長基因;4個成員的序列長度介于921~1 368 bp,內(nèi)含子數(shù)4~6個(表1)。
表1 柑橘GGP基因家族染色體定位和序列分析
4個基因家族序列通過Expasy在線軟件分析,蛋白質(zhì)氨基酸個數(shù)在307~455個,相對分子量在35 021 440~50 540 620,等電點在 5.03~6.87;4 個成員均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì),不穩(wěn)定指數(shù)在 41.35~53.20;脂溶指數(shù)89.14~96.19;4個家族成員的疏水性稍有差異,除CsGGP4為正值外,其他3個成員均為負值(表2)。
表2 柑橘GGP基因家族理化性質(zhì)和亞細胞定位
亞細胞定位結(jié)果顯示,柑橘GGP 4個家族成員存在差異,CsGGP1分布于細胞核,CsGGP2和CsGGP3位于細胞質(zhì),而CsGGP4分布于細胞膜。
蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析得出柑橘GGP基因家族主要的二級結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲和α-螺旋,分別占39%以上和33%以上;其次是延伸鏈,占16%以上;最后是β-轉(zhuǎn)角,占5%左右(表3)。
表3 柑橘GGP基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析
對柑橘 GGP基因家族啟動子區(qū)上游2 000 bp的序列進行順式作用元件分析,結(jié)果如表4顯示,4個家族成員的啟動子區(qū)域均含有與光響應、脫落酸和茉莉酸甲酯響應元件,其中光響應元件個數(shù)最多,最高達到20個;不同成員還具有水楊酸、赤霉素和生長素等其他激素信號傳導、逆境脅迫(厭氧、低溫等)與植物生長發(fā)育等結(jié)合位點。
表4 柑橘GGP基因家族順式作用元件分析
柑橘4個GGP基因家族成員在組織特異性、果皮發(fā)育和黃龍病(Huanglongbing,HLB)脅迫中表現(xiàn)不同(圖1和圖2)。4個成員中,CsGGP2在胚珠、果肉、葉片和須根等被測樣品中均高表達,尤其在果肉中,但在須根中的表達量顯著低于其他組織,不到果肉的1/10;CsGGP4成員在胚珠、葉片和須根中表達較高,尤其在須根中與CsGGP2表達量相當;CsGGP1和CsGGP3在被測樣品表達量均很低。隨著果皮發(fā)育,CsGGP2表達量呈現(xiàn)下降趨勢。須根HLB感染后,CsGGP2和CsGGP4表達量均增加。
圖2 柑橘4個GGP家族成員不同組織和HLB感染后的轉(zhuǎn)錄組表達
本研究在克里曼丁橘全基因組范圍鑒定出 GGP 家族 4個成員,分別位于4條不同染色體上,亞細胞定位分布于細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜中。啟動子順式作用元件預測4個柑橘GGP基因家族成員均含有大量光響應相關的作用元件,尤其是CsGGP2和CsGGP4。研究顯示,AsA作為電子載體或供體參與光合作用[12-13],且L-半乳糖生物合成途徑與光合作用緊密相關[1];擬南芥AsA合成量和GGP表達均受高光逆境誘導[4,14],這些結(jié)果均表明,GGP基因家族涉及光響應。
轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)顯示,CsGGP2成員表達量在被測組織均最高,表明CsGGP2是L-半乳糖生物合成途徑中的主導成員;CsGGP2在果皮發(fā)育過程中呈現(xiàn)下降趨勢,猜測CsGGP2參與柑橘果皮早期發(fā)育,這與L-半乳糖生物合成途徑被認為在葉片、綠果等綠色組織中起主要作用的研究結(jié)果一致[3-4,15]。須根感染黃龍病后,CsGGP2和CsGGP4表達均增加,表明CsGGP2和CsGGP4參與黃龍病逆境脅迫。