陳敏潔，楊超超，汪曉菲，阮松林，范慧艷*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

植物在一定的外來物質(zhì)刺激下，能夠?qū)﹄S后的病原菌侵染(包括局部侵染和系統(tǒng)侵染)產(chǎn)生抗性，稱為植物的誘導(dǎo)抗病性，又稱系統(tǒng)獲得抗性或植物免疫[1-2]。該特性充分利用了植物自身對(duì)病害發(fā)生的潛在控制能力，通過調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)、代謝系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，延遲或減輕病害的發(fā)生和發(fā)展[3]。這種給植物帶來刺激的外源生物或分子稱為植物免疫誘抗劑，是一種新型生物農(nóng)藥，具有量少而效優(yōu)、環(huán)境相容性好的特點(diǎn)，給環(huán)境保護(hù)與作物增產(chǎn)帶來良好的影響。

誘抗劑可分為生物來源與非生物來源兩大類，非生物來源的誘抗劑包括無機(jī)鹽、有機(jī)酸、寡糖類、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。對(duì)于寡糖類植物免疫誘抗劑的開發(fā)，該類激發(fā)子多來源于動(dòng)物、植物、微生物的外殼或細(xì)胞壁，在自然界含量極為豐富。目前鑒定到的寡糖類激發(fā)子主要有胞外多糖、幾丁質(zhì)、殼寡糖、木葡聚糖、海藻糖、海帶多糖等[4-6]。殼寡糖是幾丁質(zhì)脫乙?；?，經(jīng)酸解或酶解得到的可溶性堿性寡糖。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖誘導(dǎo)植物抗病時(shí)的重要誘抗信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)柑橘果實(shí)[7]、灰霉孢子[8]活性氧的產(chǎn)生，抵御病原菌的入侵；可以促使棉花[9]、草莓[10]細(xì)胞活性氧代謝發(fā)生改變，顯著誘導(dǎo)早期活性氧的迸發(fā)；特定殼寡糖濃度處理煙草細(xì)胞，可以啟動(dòng)茉莉酸合成途徑，使植物開啟抗性防御反應(yīng)[11]；通過一氧化氮合酶(NOS)催化合成NO，Ca2+參與并調(diào)節(jié)該過程，進(jìn)而影響煙草細(xì)胞相關(guān)抗性基因表達(dá)[12]。2013年杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研制出3%殼寡糖水劑型的高效廣譜免疫誘抗劑?？奠`1號(hào)(BKL1)，該制劑對(duì)葡萄、草莓、鮮食糯玉米等植物的生長(zhǎng)與抗病均有良好效果[13-16]。

浙貝母是浙江省的道地藥材之一，由于浙江省夏季高溫多雨，浙貝母栽培病害較重?；颐共　⒑诎卟〉仁钦阖惸傅某Ｒ姴『17]，生產(chǎn)上常使用化學(xué)農(nóng)藥來防控，導(dǎo)致浙貝母鱗莖農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重。本研究開展了植物免疫誘抗劑BKL1在浙貝母生產(chǎn)上的田間應(yīng)用試驗(yàn)，探討植物免疫誘抗劑對(duì)浙貝母農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和抗病性的影響，旨在為浙貝母種植中農(nóng)藥減量增效技術(shù)的探索提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)以狹葉型浙貝母為試驗(yàn)材料，于2020年11月4日在浙江中醫(yī)藥大學(xué)富春校區(qū)中藥材種苗繁育基地進(jìn)行種植，選用大小均勻的浙貝母鱗莖作為種莖，種植小區(qū)面積約15 m2(一畦寬1 m，長(zhǎng)15 m)，種植密度為20 cm×20 cm，每小區(qū)種植300株左右，3次重復(fù)。根據(jù)試驗(yàn)田土壤地力水平較低的情況，施用50～70 t·hm-2有機(jī)肥作為基肥，其他種植技術(shù)參考道地藥材浙貝母的一般標(biāo)準(zhǔn)種植技術(shù)[18-19]。

1.2 處理設(shè)計(jì)

處理1，CK(清水對(duì)照)；處理2，BKL1水劑100倍液；處理3，BKL1水劑200倍液；處理4，BKL1水劑300倍液；處理5，BKL1水劑400倍液；處理6，BKL1水劑500倍液。分別于2021年3月9日、3月23日、4月7日、4月21日共噴施4次不同濃度的BKL1，每個(gè)處理重復(fù)3次。每次噴施后1周進(jìn)行采樣以及測(cè)定。

每次采樣時(shí)隨機(jī)挑選各組10株浙貝母，分別取每株浙貝母的上中下葉各3片。選擇浙貝母健康植株中完整無損、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的具代表性植株30株測(cè)定測(cè)定株高、莖粗、鱗莖體積等。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 SPAD測(cè)定

在藥劑噴施處理后1周，用SPAD-502-日本柯尼卡美能達(dá)手持式葉綠素測(cè)定儀測(cè)量葉片SPAD。對(duì)所有處理組進(jìn)行隨機(jī)抽樣，每個(gè)處理組測(cè)量10株，每株隨機(jī)選取上、中、下層健壯無病蟲害的葉片(均在離葉尖1/3處測(cè)定)，每層測(cè)定3次，記錄數(shù)據(jù)，并取平均值。

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定

參照苯丙氨酸解氨酶(PAL)測(cè)定試劑盒說明書提取粗酶液，在290 nm波長(zhǎng)下用Bio Tek多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算苯丙氨酸解氨酶活性。

1.3.3 農(nóng)藝性狀以及產(chǎn)量、體積測(cè)定

藥劑處理噴施3次后，選擇浙貝母健康植株中完整無損、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的具代表性植株30株，測(cè)定株高、莖粗。倒苗后，收獲浙貝母的鱗莖，從每個(gè)處理組取具代表性鱗莖50個(gè)，洗凈后擦干，測(cè)量鮮重；測(cè)量鱗莖體積時(shí)，取適宜體積燒杯(最小刻度精確至0.1 mL)，倒入適量水至整數(shù)刻度，讀數(shù)并記錄，放入適量需測(cè)量的鱗莖，確保液面在燒杯刻度范圍，待液面穩(wěn)定后，讀數(shù)并記錄。兩次體積差即為所測(cè)浙貝母鱗莖的體積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2022軟件和Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀

由表1可知，與CK組相比，不同濃度BKL1處理的浙貝母株高和莖粗差異不明顯，莖粗范圍在3.41～4.14 cm。從效果綜合來看，300倍液BKL1處理組農(nóng)藝性狀表現(xiàn)最好，說明BKL1在適宜濃度能促進(jìn)浙貝母植株生長(zhǎng)(抗倒伏)。

表1 不同濃度BKL1處理對(duì)浙貝母農(nóng)藝性狀的影響

2.2 葉片SPAD

由圖1可知，與CK相比，BKL1處理組中100倍液、200倍液和300倍液的浙貝母葉片SPAD在噴施第2次和第3次后整體升高，且隨BKL1濃度下降呈整體階梯狀上升。從效果來看，藥劑處理噴施2次時(shí)，浙貝母處在生長(zhǎng)旺盛期(3月下旬至4月上旬)，葉片SPAD整體較高；藥劑處理噴施3次及以后，葉片SPAD階梯狀趨勢(shì)仍舊存在，由于處于倒伏期，光合作用下降，使栽培浙貝母整體SPAD下降。在浙貝母生長(zhǎng)旺盛期，200～300倍液BKL1處理組效果最明顯，與CK相比分別增加55.8%～88.1%，說明BKL1在適宜濃度能促進(jìn)浙貝母葉片葉色值的增加，加強(qiáng)光合作用。

圖1 BKL1處理對(duì)浙貝母葉片SPAD的影響

2.3 發(fā)病率和PAL活性

PAL的活性與植物抗病性呈正相關(guān)[20-21]。通過對(duì)浙貝母葉片PAL活性檢測(cè)(圖2)可知，與CK相比，BKL1處理中100倍液、200倍液、300倍液、400倍液組的PAL活性均有增長(zhǎng)，其中300倍液BKL1處理組PAL活性最高。說明BKL1在適宜濃度能顯著提升PAL活性，增強(qiáng)浙貝母植株抗病性?；颐共?、黑斑病是浙貝母的主要田間病害。從定植開始到收獲期，統(tǒng)計(jì)種植區(qū)浙貝母發(fā)病情況，每個(gè)處理組按300株計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理后浙貝母的病害發(fā)生率不同，經(jīng)BKL1處理的植株發(fā)病率明顯減少，400倍液BKL1處理組浙貝母植株發(fā)病率最少，為10.7%。

2.4 產(chǎn)量

由表2可知，與CK相比，BKL1處理組中浙貝母鱗莖產(chǎn)量都有明顯提高，300倍液、400倍液和500倍液BKL1處理組中浙貝母鱗莖產(chǎn)量顯著提高，其中300倍液BKL1處理組鱗莖產(chǎn)量相對(duì)增長(zhǎng)87.3%；與CK相比，浙貝母平均鱗莖體積也有顯著提高，其中300倍液BKL1處理組浙貝母平均鱗莖體積相對(duì)增長(zhǎng)43.3%，說明適宜濃度BKL1可通過增加浙貝母鱗莖的體積來提高浙貝母產(chǎn)量。

3 小結(jié)與討論

植物免疫誘抗劑是植物免疫工程技術(shù)出現(xiàn)的新領(lǐng)域，是當(dāng)前環(huán)境保護(hù)、生物農(nóng)藥等方向的研究熱點(diǎn)，具有巨大的發(fā)展前景，它的應(yīng)用使植物病蟲害的綠色防控有了新的突破，是有害生物綠色防控的新技術(shù)和新方法，是保障農(nóng)產(chǎn)品安全、減少環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥零增長(zhǎng)的有效途徑[22]。本研究供試BKL1是利用3%殼寡糖研制而成的一種高效廣譜的植物免疫誘抗劑。研究表明，適宜濃度BKL1處理能促進(jìn)浙貝母光合作用，提高葉片SPAD、增強(qiáng)PAL活性、優(yōu)化浙貝母農(nóng)學(xué)性狀、提高產(chǎn)量。綜合來看，200～400倍液BKL1處理效果較好，能夠一定程度上激活浙貝母的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)浙貝母抗病能力，促進(jìn)浙貝母增產(chǎn)和品質(zhì)改善。

浙貝母是傳統(tǒng)“浙八味”藥材之一，它的生長(zhǎng)期是當(dāng)年9月份至次年5月份，從種植至采收一直處于氣溫比較低的階段，蟲害相對(duì)而言不是特別嚴(yán)重，而病害的發(fā)生比較普遍。作為歷史上的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，浙貝母在浙江地區(qū)被廣泛栽培，部分中藥材生產(chǎn)基地由于多年連續(xù)種植浙貝母，常見病害加重，最終導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降，而部分藥農(nóng)盲目使用殺菌劑更是不利于可持續(xù)發(fā)展。在感病季節(jié)，連茬、種植密度、地勢(shì)等因素都會(huì)造成病害出現(xiàn)甚至群體暴發(fā)，需要科學(xué)合理地防控病害，來保證浙貝母入藥部位的產(chǎn)量和質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)效益化可持續(xù)發(fā)展。目前，政府利用增施有機(jī)肥、測(cè)土配方施肥等途徑推廣農(nóng)藥技術(shù)，研究從施肥、大棚栽培、種植密度、輪套種、病害防治和繁殖方式等角度來探究提高浙貝母產(chǎn)量的有效途徑[23]。如何應(yīng)用浙貝母種植過程中農(nóng)藥的減量增效技術(shù)以及達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)浙貝母鱗莖生產(chǎn)計(jì)劃是本研究的目標(biāo)，而免疫誘抗劑通過提高植物免疫誘抗性，能從根本上減少或避免農(nóng)藥的使用。本試驗(yàn)供試的BKL1不僅提高植物自身抗病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還能提高藥材安全性和產(chǎn)量，為浙貝母的綠色種植提供保障。