徐筋燕，何曉蘭，邵明燦，郭書巧

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

栝樓又稱瓜蔞，屬于葫蘆科栝樓屬，是我國傳統(tǒng)的中藥材。栝樓的藥用價值很高，其根部即天花粉，具有促使流產(chǎn)、抗腫瘤、抗艾滋病等功能；其果實(shí)為全瓜蔞，具有擴(kuò)張冠狀動脈、降低心肌收縮力、抗血小板凝集、抗?jié)?、抗腫瘤等作用[1-2]；其種子稱瓜蔞籽，具有化痰止咳作用。由于瓜蔞籽口感極佳，近年來也逐漸成為一種休閑食品，廣受大眾的喜愛。由于栝樓極高的藥用及經(jīng)濟(jì)價值，已逐漸成為蘇北地區(qū)富民增收的重要產(chǎn)業(yè)。近年來在江蘇地區(qū)廣泛種植，種植面積約占全國栝樓種植面積的50%[3]。

目前生產(chǎn)上栝樓的主要繁殖方式為種子繁殖以及塊根繁殖。栝樓為雌雄異株植物，在種子繁殖過程中雄株占比約70%。由于栝樓在栽培過程中雌雄株的合理搭配為10∶1，僅通過種子繁殖難以控制植物性別，容易造成不必要的資源浪費(fèi)。塊根繁殖可以明確植株的性別，對于雌雄株的搭配更為合理，也可以減少資源的浪費(fèi)。但是塊根繁殖也有一些明顯的缺點(diǎn)，如繁殖系數(shù)低，容易造成品種嚴(yán)重退化等。利用組織培養(yǎng)的方式對栝樓進(jìn)行快繁，可以明確進(jìn)行雌雄株的種苗繁育，且繁殖系數(shù)高，繁殖周期短，不受外界環(huán)境的干擾；此外還能對材料進(jìn)行脫毒復(fù)壯，防止品種退化。

雖然目前已有針對栝樓組織培養(yǎng)的研究，但是研究結(jié)果之間存在著較大的差異，這可能與栝樓品種的基因型有關(guān)[4-6]。蘇蔞1號是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牽頭，江蘇省鹽城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、江蘇省阜寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局和阜寧縣永發(fā)瓜蔞合作社合作育成的栝樓新品種。該品種生長勢強(qiáng)，商品性好，產(chǎn)量穩(wěn)定，在試種過程中廣受農(nóng)民的好評。為了加快蘇蔞1號的推廣面積并保持品種的穩(wěn)定性，本研究針對蘇蔞1號開展組培快繁研究，為獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為栝樓新品種蘇蔞1號。試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所組培室以及智能溫室和試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試材料種植地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院智能溫室和試驗(yàn)基地，移栽后的幼苗種植地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院智能溫室。本試驗(yàn)誘導(dǎo)和增殖所用的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(MS)，生根培養(yǎng)基為1/2 MS，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照16 h·d-1。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

分別從溫室和大田選擇健壯、無病的蘇蔞1號藤蔓，用流水沖洗30 min后，剪成約2 cm含莖節(jié)的小段。將剪好后的小段用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗2次，放入超凈工作臺備用。使用0.1% HgCl2分別消毒10、15、20、25 min后，利用無菌水沖洗5次，并在無菌水中繼續(xù)浸泡1～2 h，以清除殘留的升汞。將莖段取出，放在滅菌的濾紙上吸干水分，切除莖段兩端變色部位，接入MS中。在組培室中培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)消毒效果。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)

叢生芽誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，試驗(yàn)所用6-芐氨基嘌呤(6-BA)濃度為0.5、2.0 mg·L-1，噻苯隆(TDZ)濃度為0.5、1.0 mg·L-1，萘乙酸(NAA)濃度為0.1、0.5 mg·L-1。研究不同濃度6-BA和NAA、TDZ和NAA組合對栝樓叢生芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2 MS，實(shí)驗(yàn)室所用NAA濃度為0.1、0.2和0.5 mg·L-1，吲哚丁酸(IBA)濃度為0.1、0.2和0.5 mg·L-1。研究不同濃度NAA和IBA及兩者組合對栝樓生根的影響。

1.2.4 生長和移栽時間

為了保證幼苗質(zhì)量并縮短生長周期，在栝樓幼苗誘導(dǎo)出不定根后，繼續(xù)在培養(yǎng)基中分別生長30、40和60 d，觀察培養(yǎng)時間對幼苗生長和移栽成活率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)環(huán)境與消毒時間對蘇蔞1號外植體萌芽率的影響

外植體培養(yǎng)2周后，觀察不同種植環(huán)境和滅菌時間對栝樓外植體消毒效果和萌芽率的影響，并統(tǒng)計(jì)污染外植體數(shù)和萌芽的外植體數(shù)。表1顯示，在0.1% HgCl2消毒處理20 min后，溫室的栝樓外植體污染率降至3.3%，萌芽率達(dá)到73.3%，已符合無菌效果；處理25 min后，溫室的栝樓外植體褐化死亡比例顯著上升，達(dá)到42.5%。由此可得，溫室的栝樓0.1% HgCl2消毒的時間控制在20 min，可獲得最佳無菌要求。大田的栝樓在0.1% HgCl2消毒20 min后，仍有28.3%的污染率，當(dāng)消毒時間延長至25 min后，污染率降至9.2%，萌芽率達(dá)到62.5%，基本符合無菌條件。大田的栝樓植株明顯比溫室種植的健壯，在0.1% HgC2處理25 min后，溫室的栝樓外植體褐化死亡率達(dá)到42.5%，而大田的僅28.3%。由上可知，溫室的栝樓0.1% HgCl2最佳消毒時間為20 min，大田的栝樓最佳消毒時間為25 min。

表1 不同種植環(huán)境和滅菌時間對蘇蔞1號外植體萌芽率的影響

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑對蘇蔞1號叢生芽誘導(dǎo)的影響

本研究采用不同濃度的6-BA和NAA、TDZ和NAA組合進(jìn)行蘇蔞1號叢生芽誘導(dǎo)。當(dāng)無菌外植體莖伸長，莖節(jié)處嫩芽長至0.5～1.0 mm時，剝?nèi)∧垩浚胖糜诤胁煌瑵舛壬L調(diào)節(jié)劑的MS中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率。結(jié)果(表2)顯示，10種激素組合中，叢生芽誘導(dǎo)率最高的為0.5 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA組合，誘導(dǎo)率達(dá)75.6%。其余依次為1.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA組合(誘導(dǎo)率55.6%)，0.5 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA組合(誘導(dǎo)率42.2%)和2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA組合(誘導(dǎo)率35.6%)。通過比較結(jié)果，得出TDZ的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于6-BA，因此，栝樓叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+(0.1～0.5)mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA組合。

表2 不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對蘇蔞1號叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑對蘇蔞1號生根的影響

表3顯示，誘導(dǎo)生根率最高的為0.5 mg·L-1IBA，達(dá)91.1%，但該配方會導(dǎo)致根部膨大且有少量愈傷發(fā)生，后期試驗(yàn)結(jié)果也顯示，幼苗移栽成活率較低；其次為0.1 mg·L-1NAA，生根率達(dá)到80.0%，幼苗根系粗壯，側(cè)根多，且植株生長正常；0.1 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA組合也可獲得較高的生根率(73.3%)，但根部膨大，易與莖部脫落；0.5 mg·L-1NAA雖然生根率不高(46.7%)，但根部較粗壯，根毛密集，植株生長狀況良好；0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA組合生根效果最差(37.8%)，且植株生長緩慢。綜上可知，對蘇蔞1號生根效果最好的生長調(diào)節(jié)劑組合應(yīng)為1/2 MS+(0.1～0.5)mg·L-1NAA。

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑對蘇蔞1號生根的影響

2.4 不同培養(yǎng)和煉苗時間對蘇蔞1號幼苗移栽成活率的影響

前期在對栝樓組培幼苗進(jìn)行移栽的過程中發(fā)現(xiàn)，生根后的幼苗在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間越長，地上部莖稈越健壯，但是根部功能會隨著培養(yǎng)時間增加而逐漸衰退。為了獲得更健壯的幼苗且提高其移栽成活率，對生根后的栝樓幼苗在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間和煉苗時間進(jìn)行了研究。表4顯示，生根后的幼苗在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d，煉苗2～4 d可以得到較高的成活率(81.7%～85.8%)，但是煉苗時間延長至6 d時，幼苗成活率就會大幅下降(62.5%)。

表4 培養(yǎng)時間和煉苗時間對蘇蔞1號組培苗成活率的影響

幼苗在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長45 d，煉苗2 d，移栽成活率為78.3%，而當(dāng)延長煉苗時間后，幼苗的移栽成活率會急劇下降。在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至60 d，煉苗2～4 d時，幼苗的移栽成活率降至40%以下，煉苗6 d時移栽成活率僅25.8%。通過以上結(jié)果可得，栝樓幼苗生根后在培養(yǎng)基中的最佳培養(yǎng)時間為30～45 d，最佳煉苗時間為2 d。

3 討論

組培快繁技術(shù)繁殖周期短，不受外界環(huán)境影響，可以維持優(yōu)質(zhì)栝樓品種的種苗優(yōu)勢，解決種子繁殖帶來的難以控制性別問題和塊根繁殖帶來的繁殖系數(shù)低和品種退化等問題，是維持栝樓品質(zhì)和產(chǎn)量的一種有效的方法。從目前研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，不同栝樓品種之間組培所需的植物激素濃度存在著一定的差異，這可能與栝樓的基因型等因素相關(guān)。

室內(nèi)種植栝樓不受外界環(huán)境影響和季節(jié)限制，全年可以進(jìn)行外植體取樣研究和擴(kuò)繁，但植株生長偏弱，同時也會消耗大量的能源；田間種植栝樓植株健壯，但是取樣時間受季節(jié)限制較大。為了更好地進(jìn)行栝樓組培苗的擴(kuò)繁，通常2種生長環(huán)境的外植體均會取樣，但是0.1% HgCl2對2種外植體消毒效果存在一定的差異。本研究通過對栝樓培養(yǎng)環(huán)境與消毒時間進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)種植的栝樓外表污染物較少，但是植株較弱，利用0.1% HgCl2處理20 min即可達(dá)到無菌效果，若延長處理時間則會降低植株萌芽率；田間種植的栝樓外部污染較嚴(yán)重，但植株生長健壯，需要將0.1% HgCl2處理時間延長至25 min才基本達(dá)到無菌效果。

本研究中蘇蔞1號叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+(0.1～0.5)mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA組合。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，相比傳統(tǒng)的利用6-BA+NAA組合進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，TDZ+NAA組合對蘇蔞1號叢生芽誘導(dǎo)的效果更佳。在生根過程中發(fā)現(xiàn)外源添加NAA和IBA都能誘導(dǎo)蘇蔞1號幼苗發(fā)根，但是添加IBA會誘導(dǎo)根系發(fā)生愈傷，且植株移栽后不易成活。而外源添加適量的NAA后，栝樓幼苗的根系粗壯，生長正常，因此，蘇蔞1號生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+(0.1～0.5)mg·L-1NAA。

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，蘇蔞1號生根后生長迅速，14 d以后即已成苗，但是此時植株莖稈瘦弱，移栽成活率偏低。在培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)28～42 d后，植株莖稈健壯，但是根系功能逐漸衰退。為了平衡植株莖部發(fā)育和根系功能之間的關(guān)系，縮短組培周期，提高組培效率和幼苗移栽成活率，本研究對蘇蔞1號的培養(yǎng)時間和煉苗時間進(jìn)行了試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，幼苗生根后在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30～45 d，煉苗2 d效果最佳。

本試驗(yàn)建立了栝樓新品種蘇蔞1號的組培快繁體系，解決了種子繁殖雌雄性比例不可控制和塊根繁殖繁殖系數(shù)低和易造成品種退化等問題，縮短了蘇蔞1號繁育周期，并可提供大量優(yōu)質(zhì)的組培苗，為維持蘇蔞1號的品種優(yōu)勢和加快其推廣應(yīng)用提供了重要的技術(shù)支持。