陸 川，孫元睿，楊麗紅，楊 明

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種進(jìn)行性、特異性糖尿病并發(fā)癥，由高糖引起的不可逆性視網(wǎng)膜損傷，特點(diǎn)是發(fā)生微動(dòng)脈瘤、毛細(xì)血管閉塞、纖維化和新生血管增生等[1]。目前，全球4.68億糖尿病患者中約有9000萬人患有不同程度DR，預(yù)計(jì)到2030年將有約1.91億人被診斷出患有DR[2]。早期診斷和預(yù)防DR發(fā)展對(duì)于避免或延遲視力喪失和降低治療相關(guān)成本尤為必要。據(jù)報(bào)道，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程是DR疾病進(jìn)展中新生血管生成的影響因素之一[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是EMT的重要調(diào)節(jié)因子，可以特異性參與新生血管增殖，還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，與DR發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可通過轉(zhuǎn)錄后等方式調(diào)控基因表達(dá)，影響內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激等，參與糖尿病微血管病變進(jìn)展[5]。無遠(yuǎn)端同源框6反義1(non-distal homeobox 6 antisense 1，DLX6-AS1)屬于發(fā)育調(diào)控的lncRNA，其在腎細(xì)胞癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性，參與EMT途徑，發(fā)揮促癌基因功能[6]。微小RNA(microRNA，miR)屬于高度保守的短鏈非編碼RNA，與糖脂代謝異常相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)參與DR的血管生成、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)過程[7]。近期，Xia等[8]的研究顯示，miR-335-3p在DR患者血清和高糖處理的APRE-19細(xì)胞中顯著下調(diào)，miR-335-3p可以靶向抑制VEGF表達(dá)。然而，血清lncRNA DLX6-AS1在DR中表達(dá)變化以及l(fā)ncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p與DR患者微血管損傷的關(guān)系尚未研究。本研究通過檢測(cè)DR患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p表達(dá)水平，分析二者與DR患者微血管損傷的關(guān)系，為深入解析DR發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。選取2019-02/2021-12我院2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者160例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合T2DM分型及診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)無全身系統(tǒng)性疾??；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并精神障礙；(2)T1DM、其他特殊類型DM；(3)白內(nèi)障、青光眼、晶狀體疾病、屈光改變等眼部疾??；(4)糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病高滲性昏迷急性并發(fā)癥；(5)合并心、肝、腎等嚴(yán)重功能障礙；(6)合并感染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均對(duì)研究知情同意。

1.2方法

1.2.1收集基本臨床資料記錄入組患者的性別、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、糖尿病病程、甘油三酯(triglyceride，TG)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c，HbA1c)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、吸煙史、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、總膽紅素(total bilirubin，Tb)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)等基本臨床資料。

1.2.2采集標(biāo)本所有患者均在隔夜空腹?fàn)顟B(tài)下于次日清晨入院抽取肘靜脈血，離心后取上層血清，分為兩份:一份用于后續(xù)檢測(cè)血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p相對(duì)表達(dá)水平；另一份用于測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以及VEGF，均暫存于-80℃冰箱。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)血清lncRNADLX6-AS1和miR-335-3p表達(dá)水平

1.2.3.1檢測(cè)lncRNADLX6-AS1表達(dá)水平使用TRIzol試劑(貨號(hào)：E01010A，廣州復(fù)能基因有限公司)提取總RNA，Nano-3000超微量核酸蛋白分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)檢測(cè)RNA濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：6215A，Takara公司)得到cDNA，CFX96 Real-Time System(Bio-Rad，美國(guó))檢測(cè)系統(tǒng)，采用定量PCR試劑盒(貨號(hào)：RR420L，Takara公司)進(jìn)行信號(hào)采集。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平。

1.2.3.2檢測(cè)miR-335-3p表達(dá)水平從-80℃冰箱取出凍存樣品，采用miRNA提取試劑盒(貨號(hào)：9753A，Takara公司)得到miRNA，取2μg RNA按照廣州復(fù)能基因有限公司的miRNA專用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：QP113)，以及定量試劑盒(貨號(hào)：QP115)說明書操作，同樣在CFX96定量?jī)x器上進(jìn)行反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-335-3p表達(dá)水平。各引物序列見表1。

1.2.4檢測(cè)VEGF和ECs及EPCs水平采用百奧萊博公司的ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF表達(dá)水平(貨號(hào)：ZN2493)，按照說明書操作。采用貝克曼庫爾特公司的流式細(xì)胞儀(型號(hào)：CytoFLEX LX)檢測(cè)外周血中ECs、EPCs比例。

2結(jié)果

2.1三組患者臨床資料比較本研究共納入患者160例，其中男68例、女92例，年齡42～72(平均59.39±6.38)歲。所有患者均經(jīng)眼底彩色照相及眼底鏡檢查，并按照DR臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[10]，分為無DR(NDR)組69例、非增殖型DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)組48例、增殖型DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)組43例。PDR組與NPDR組年齡、糖尿病病程、SBP、DBP、FBG以及HbA1c均高于NDR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而性別、LDL、TC、ALT、Tb、BMI、吸煙史、AST、HDL比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組患者臨床資料比較

2.2三組患者各指標(biāo)比較三組患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p、VEGF表達(dá)水平、ECs和EPCs比例比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PDR組和NPDR組血清lncRNA DLX6-AS1、VEGF表達(dá)水平及ECs比例顯著高于NDR組，而PDR組高于NPDR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NDR組、NPDR組、PDR組EPCs比例，miR-335-3p表達(dá)水平逐次下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組患者各指標(biāo)比較

2.3血清lncRNADLX6-AS1與miR-335-3p表達(dá)水平的相關(guān)性生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，血清lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。DR患者血清lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性(r=-0.668，P<0.01)，見圖2。

圖1 血清lncRNA DLX6-AS1序列中含有與miR-335-3p互補(bǔ)的核苷酸序列。

圖2 血清lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p表達(dá)水平的相關(guān)性。

2.4血清lncRNADLX6-AS1和miR-335-3p與各指標(biāo)的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NPDR組和PDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，lncRNA DLX6-AS1與VEGF呈正相關(guān)，miR-335-3p與VEGF呈負(fù)相關(guān)。PDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1與ECs呈正相關(guān)，與EPCs呈負(fù)相關(guān)；miR-335-3p與ECs呈負(fù)相關(guān)，與EPCs呈正相關(guān)性(均P<0.01)，見表4～6。

表4 NDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p與VEGF、ECs、EPCs的相關(guān)性

表5 NPDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p與VEGF、ECs、EPCs的相關(guān)性

表6 PDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p與VEGF、ECs、EPCs的相關(guān)性

2.5影響T2DM患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素分析以T2DM患者發(fā)生DR為因變量，進(jìn)行單因素分析，并將結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的糖尿病病程、SBP、DBP、FBG、HbA1c、lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p、ECs、EPCs、VEGF為自變量納入多因素Logistic回歸分析，采用向前逐步回歸法，變量納入標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為α=0.1。結(jié)果顯示，血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p、VEGF是影響T2DM患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素，見表7、8。

表7 T2DM患者發(fā)生DR的單因素Logistic回歸分析

表8 T2DM患者發(fā)生DR的多因素Logistic回歸分析

3討論

DR為微血管系統(tǒng)的進(jìn)行性改變導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血、新血管形成、視網(wǎng)膜通透性改變和黃斑水腫，NPDR是DR的早期階段，PDR是DR的晚期階段[11]。視網(wǎng)膜新生血管生成與VEGF調(diào)節(jié)作用相關(guān)，是DR進(jìn)展的關(guān)鍵因素。VEGF在視網(wǎng)膜的多種細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)中表達(dá)，VEGF的異常高表達(dá)是視網(wǎng)膜新生血管形成和血管滲漏的主要原因，并被認(rèn)為是DR病變中抗血管生成的治療靶點(diǎn)[4]。因此，明確與視網(wǎng)膜血管生成相關(guān)的調(diào)控因子，探究其病理機(jī)制，為有效地早期預(yù)防和治療DR策略提供依據(jù)。

lncRNA參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、X染色體沉默等生理和病理過程，其異常表達(dá)與糖尿病、DR、脈絡(luò)膜新生血管等有關(guān)[5]。血清lncRNA DLX6-AS1屬于DLX基因家族，位于人類染色體7q21.3區(qū)域，目前血清lncRNA DLX6-AS1的相關(guān)報(bào)道集中于惡性腫瘤。研究顯示，血清lncRNA DLX6-AS1在惡性腫瘤如肺癌、宮頸癌、胃癌中發(fā)揮促癌作用[12]。近期有報(bào)道稱，血清lncRNA DLX6-AS1在糖尿病腎病患者及小鼠模型的腎組織中上調(diào)表達(dá)[13]。下調(diào)血清lncRNA DLX6-AS1后，高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化均受到抑制[14]。本研究結(jié)果顯示，PDR組和NPDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平顯著高于NDR組，說明lncRNA DLX6-AS1表達(dá)失調(diào)可能參與DR進(jìn)展。研究證實(shí)，lncRNA DLX6-AS1在乳腺癌、膀胱癌、胃癌中的高表達(dá)能夠增強(qiáng)EMT，抑制化學(xué)敏感性，推動(dòng)腫瘤進(jìn)展[12]。Wang等[15]有關(guān)膀胱癌的研究顯示，lncRNA DLX6-AS1通過靶向miR-195-5p和介導(dǎo)VEGFA/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成，推動(dòng)癌癥進(jìn)展，并認(rèn)為是潛在膀胱癌治療靶點(diǎn)。鑒于VEGF是EMT的調(diào)節(jié)因子之一，而EMT與腫瘤血管重構(gòu)有關(guān)[3]。NDR組、NPDR組以及PDR組患者血清中VEGF逐次升高，且NPDR組、PDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示lncRNA DLX6-AS1可能通過間接調(diào)控VEGF參與EMT進(jìn)程，從而在DR發(fā)展過程中促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成。

近年來一系列研究表明miRNA與血管發(fā)生、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)、氧化應(yīng)激、糖尿病病及其并發(fā)癥有關(guān)[1]。本研究中PDR組、NPDR組患者血清miR-335-3p表達(dá)水平顯著低于NDR組，而PDR組又低于NPDR組，說明miR-335-3p的降低可能對(duì)DR發(fā)生以及嚴(yán)重程度有一定作用。另有研究顯示，H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老并上調(diào)miR-335-5p表達(dá)，而miR-335-5p的過表達(dá)會(huì)靶向抑制血清可溶性klotho蛋白，促進(jìn)氧化應(yīng)激，加速內(nèi)皮細(xì)胞衰老[16]。另有研究顯示，miR-335-3p在骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，miR-335-3p的過表達(dá)會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致腫瘤微血管密切降低[17]。提示miR-335-3p可能與DR進(jìn)展中的血管生成、氧化應(yīng)激有關(guān)。近期，Xia等[8]有關(guān)DR的研究顯示，miR-335-3p能夠靶向抑制VEGF表達(dá)。血管生成與EMT密切相關(guān)，而VEGF參與EMT過程。本研究結(jié)果顯示，NPDR組和PDR組患者血清miR-335-3p表達(dá)水平與VEGF存在負(fù)相關(guān)，說明miR-335-3p的異常低表達(dá)可能導(dǎo)致VEGF高表達(dá)，從而推動(dòng)視網(wǎng)膜血管新生。

本研究經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，且lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p存在負(fù)相關(guān)，提示lncRNA DLX6-AS1與miR-335-3p可能存在靶向關(guān)系，共同參與糖尿病患者DR過程。ECs、EPCs能夠直接反映DR患者微血管內(nèi)皮功能損傷。本研究中NDR組、NPDR組和PDR組患者ECs、EPCs比例變化與李開元等[18]研究一致。說明T2DM患者合并DR將會(huì)破壞患者血管內(nèi)皮功能，DR程度越加重，內(nèi)皮損壞也隨之加重。PDR組患者血清lncRNA DLX6-AS1與ECs存在正相關(guān)，與EPCs存在負(fù)相關(guān)性；miR-335-3p表達(dá)水平與ECs存在負(fù)相關(guān)，與EPCs存在正相關(guān)性，提示lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p可能與ECs、EPCs存在相互作用，并共同參與調(diào)控DR過程。此外，多因素分析顯示，lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p以及VEGF是影響DR的危險(xiǎn)因素，提示及時(shí)監(jiān)控血清lncRNA DLX6-AS1、miR-335-3p以及VEGF水平，有利于盡早診斷和防治DR病情。

綜上所述，DR患者血清中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1上調(diào)表達(dá)，miR-335-3p低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，其異常表達(dá)均與DR患者微血管損傷有關(guān)。