程華春，王文斌，莫靜，聶晶，，汪波

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430062；3.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075)

中藥五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子；南五味子為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，五味子和南五味子均作五味子使用，自《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版開(kāi)始將二者作為兩個(gè)品種分開(kāi)收錄并制定不同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)性味歸經(jīng)、功能主治沒(méi)有進(jìn)行區(qū)分，臨床用藥也沒(méi)有明確規(guī)定，二者常常被混用[2]。對(duì)二者的療效各時(shí)期醫(yī)藥學(xué)家持不同觀點(diǎn)[3]，五味子偏于補(bǔ)益五臟，而南五味子斂肺平喘功效更佳，在木脂素類型和含量方面也存在顯著差異[4-6]，化學(xué)成分的差異可能是其功效不同的主要原因。此外，二者市場(chǎng)價(jià)格差異很大，但外觀形態(tài)相似，加工炮制后使鑒定更加困難，致使兩者常摻混出售，給臨床用藥有效性和安全性帶來(lái)巨大隱患。因此，開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確鑒別五味子及南五味子的方法對(duì)安全用藥具有重要意義。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種DNA定性和半定量分析的核酸檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè) 40～50 個(gè)核苷酸序列，每個(gè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度唯一，可通過(guò)毛細(xì)管電泳分離判斷目標(biāo)基因的有無(wú)及相對(duì)含量[7-8]，已廣泛用于基因診斷、甲基化檢測(cè)、遺傳疾病分析等多個(gè)分子學(xué)診斷領(lǐng)域[9-11]。本研究基于五味子ITS2序列38bp處的T/G變異位點(diǎn)[12]，設(shè)計(jì)多重連接依賴性探針，利用MLPA技術(shù)高效、快速、特異等優(yōu)勢(shì)，并與熔解曲線相結(jié)合，建立五味子和南五味子的熔解曲線模型，并根據(jù)熔解曲線Tm值的差異，建立中藥材五味子和南五味子的分子鑒定方法，為準(zhǔn)確鑒別五味子、南五味子及其摻混品提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 五味子(批號(hào)120922-201610)、南五味子(批號(hào)121118-201003)對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，31份商品藥材收集于四川荷花池、安徽亳州、河北安國(guó)等藥材市場(chǎng)，經(jīng)湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)研究中心肖凌博士鑒定，16份為五味子，15份為南五味子，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 五味子和南五味子樣品信息 Tab.1 Sample information of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera

1.2儀器 電子天平(MS204S，瑞士梅特勒托利多科技有限公司，感量：0.1 mg)，冷凍高速離心機(jī)(75002420型，美國(guó)Thermo Fisher公司，離心半徑：8 cm)，超微量分光光度計(jì)(Nano drop-2000，美國(guó)Thermo Fisher公司)，PCR擴(kuò)增儀(T100型，美國(guó)Bio-Rad)，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，DYY-10C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，微波爐(格蘭仕)，MyGo Mini(Life Technologies，Carlsbad，California)，SYERGYUV 超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore)，GGI54TW蒸汽消毒鍋(ZEALWAY)，BCD-25TMPM冰箱(海爾)，MX-RL-E旋轉(zhuǎn)混旋儀(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，LWB-26雙列六孔電熱恒溫水浴鍋(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)，UF55干燥箱(德國(guó)美墨爾特公司)，手動(dòng)移液器(德國(guó)艾本德股份公司)。

1.3試劑 乙二胺四乙酸(分析純，批號(hào)：20140728)，氯化鈉(分析純，批號(hào)：20150519)，三氯甲烷(分析純，批號(hào)：20200601)，異戊醇(分析純，批號(hào)：20141114)，異丙醇(分析純，批號(hào)：20190902)，無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)：20210510)，DDH2O，PVP-40(BS912，biosharp，純度≥99.0%)，β-Mercaptoethanol (M8210，Solarbio)，CTAB(C8440，Solarbio)，1.5 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(T010，Solarbio)，植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03，TSINGKE)，DNA產(chǎn)物純化試劑盒(D1300，Solarbio)，金牌Mix(green)(TSE101，TSINGKE)，瓊脂糖(BIOWEST，182215)，DL 1000 DNA Marker (Takara公司)，9°NTMDNA ligase (M0238S，TSINGKE)，2×T5 Fast qPCR Mix (SYBE Green Ⅰ)(TSE202，TSINGKE)，引物和MLPA 探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1MLPA探針設(shè)計(jì) 在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載五味子和南五味子ITS2序列，導(dǎo)入MEGA6軟件篩選主導(dǎo)單倍型并進(jìn)行比對(duì)，五味子ITS2序列第38個(gè)堿基為G，南五味子為T，且該位點(diǎn)較穩(wěn)定。在該位點(diǎn)上下游各截取適宜長(zhǎng)度設(shè)計(jì)兩對(duì)探針，使用UNAfold(http：//www.unafold.org/mfold/ applications/dna-folding-form.php)網(wǎng)站對(duì)探針質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，在NCBI GenBank中通過(guò)BLAST搜索評(píng)估探針序列的特異性，使用Primer3(https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)網(wǎng)站設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，設(shè)計(jì)好的引物和探針交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。新合成的引物和探針使用前在冷凍高速離心機(jī)中12 000 r·min-1離心30 min，按照標(biāo)示加入緩沖液配成10 μmol·L-1的溶液儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋成1 μmol·L-1工作溶液備用。探針和引物序列信息見(jiàn)表2。

表2 MLPA探針和引物序列信息 Tab.2 MLPA probe and primer sequence information

1.4.2樣品DNA的制備 分別取對(duì)照藥材和樣品粉末50～80 mg，參照文獻(xiàn)[13]的改良CTAB法提取樣品DNA并做適當(dāng)修改：將樣品放入2 mL離心管中，加入兩粒鋼珠，于研磨儀中研磨2 min，向研磨好的樣品中加入CTAB提取液并于65 ℃下水浴加熱1 h，每隔10 min搖勻一次，水浴后加入等體積三氯甲烷/異戊醇(24：1)，顛倒搖勻后12 000 r·min-1離心5 min。取上清液加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24：1)，顛倒搖勻后12 000 r·min-1離心5 min。將冰的異丙醇加入到1.5 mL離心管中，然后取等體積上清液加入到該離心管，于-20 ℃冰箱放置30 min后拿出，從上往下吸取加入到吸附柱，12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中廢液。加入無(wú)水乙醇，靜置5 min，12 000 r·min-1離心1 min，棄廢液，重復(fù)操作兩次?？瘴街?2 000 r·min-1離心2 min，將吸附柱移入1.5 mL離心管中，打開(kāi)吸附柱蓋子，風(fēng)干。風(fēng)干后加入5 ℃預(yù)熱的TE緩沖液40～80 μL ，靜置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，制備好的DNA樣品原液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 含量，根據(jù)A260/A280評(píng)估DNA質(zhì)量，當(dāng)A260/A280比值<1.8時(shí)，說(shuō)明可能有蛋白質(zhì)污染，當(dāng)比值>2.0時(shí)，可能有RNA存在，該比值在1.8～2.0范圍內(nèi)表明DNA質(zhì)量良好[13-14]。取質(zhì)量較好的DNA用擴(kuò)增引物WWZ-F和WWZ-R進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，隨后參照試劑盒中說(shuō)明書(shū)步驟純化，得到MLPA反應(yīng)的DNA模板。將反應(yīng)模板逐步稀釋，得到不同含量的DNA模板。另取DNA模板制成摻混樣品，使南五味子所占比例依次為90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，10%，5%。制備好的樣品保存在-20 ℃冰箱中供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.3MLPA-熔解反應(yīng) 取樣品DNA1 μL，探針1.5 μL，加入TE緩沖液5.5 μL，混勻后置PCR儀中進(jìn)行雜交反應(yīng)，98 ℃變性5 min，70 ℃雜交20 min，45 ℃取出[15]。雜交完成后，取DNA雜交產(chǎn)物1.28 μL，加入9°N DNA ligase連接酶體系6.72 μL，置PCR儀中45 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，使探針連接成一條完整鏈。冷卻后取5 μL連接產(chǎn)物，加入2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，正向引物Primer_F 0.8 μL，反向引物Primer_R 0.8 μL，50×Rox Reference Dye Ⅰ 0.4 μL，加DDH2O補(bǔ)齊到20 μL體系，95 ℃ 60 s ；95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。95 ℃ 保溫3 min后進(jìn)行熔解程序，熒光采集溫度設(shè)置為45～97 ℃(0.05 ℃·s-1)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1探針特異性分析 將表 2中所列探針按照 MLPA 擴(kuò)增反應(yīng)要求制備成單一探針和混合探針，分別以五味子及南五味子對(duì)照藥材提取的DNA以及混合DNA為模板進(jìn)行MLPA-熔解反應(yīng)。單一探針特異性結(jié)果見(jiàn)圖1A。從圖中可以看出，五味子DNA模板與五味子探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生82.3 ℃熔解曲線峰；南五味子DNA模板與南五味子探針進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生80.7 ℃熔解曲線峰。五味子探針與南五味子DNA模板、南五味子探針與五味子DNA模板以及以TE緩沖液1 μL代替DNA模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，均不產(chǎn)生熔解曲線峰。表明兩個(gè)物種只與其對(duì)應(yīng)的MLPA探針進(jìn)行雜交，不出現(xiàn)非特異性熔解曲線峰，可以認(rèn)為單一探針的特異性良好?；旌咸结樚禺愋越Y(jié)果見(jiàn)圖1B。制備的混合探針?lè)謩e與五味子、南五味子DNA模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別產(chǎn)生82.3和80.7 ℃熔解曲線峰，與單一探針結(jié)果一致，說(shuō)明兩種探針混合后并不影響探針特異性，表明混合探針特異性良好。

A.單一探針特異性；B.混合探針特異性。圖1 探針特異性實(shí)驗(yàn)熔解曲線圖譜 A.Single probe specificity ；B.Mixed probe specificity.Fig.1 Melting curve of probe specificity test

2.2敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將五味子、南五味子的DNA模板量逐漸由高降低，分別與混合探針雜交進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，驗(yàn)證方法的靈敏度。當(dāng)五味子模板DNA量為221.5，109.4，50.5，25.2，14.1，11.1，5.7，2.6，1.2，0.9，0.45，0.25 ng，南五味子模板DNA量為221.3，110.5，55.1，27.1，11.2，10.3，5.5，1.6，1.1，0.8，0.55，0.4 ng時(shí)，可產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的熔解曲線峰，熔解曲線的峰高與模板DNA的量不存在相關(guān)性。直到五味子、南五味子模板DNA量降至0.1，0.2 ng時(shí)，熔解曲線接近于水平(圖2，圖3)。此結(jié)果表明MLPA技術(shù)鑒別這兩個(gè)物種有較高的靈敏度，五味子的檢出限為0.1 ng，南五味子的檢出限為0.2 ng，且此方法的重復(fù)性好，因而可以用于市場(chǎng)上五味子和南五味子的鑒定。

圖2 五味子探針靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Fig.2 The sensitivity test results of Schisandra chinensis probe

圖3 南五味子探針靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Fig.3 The sensitivity test results of Schisandra sphenanthera probe

2.3混合樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將五味子和南五味子DNA模板按比例混合進(jìn)行MLPA反應(yīng)，檢測(cè)該方法是否適合檢測(cè)混合樣品，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)南五味子所占比例為80%，70%，60%，50%，40%，30%時(shí)，能檢測(cè)到歸屬于五味子(Tm=82.3 ℃)和南五味子(Tm=80.7 ℃)的熔解曲線雙峰。當(dāng)南五味子比例下降至20%及更低，北五味子比例下降至10%及更低時(shí)，便只產(chǎn)生單一的熔解曲線峰。這表明當(dāng)五味子樣品中南五味子所占比例≥30%或者南五味子樣品中五味子所占比例時(shí)≥20%時(shí)可用此方法來(lái)檢測(cè)摻混樣品。

圖4 混合樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Fig.4 Test results of mixed samples

2.4市場(chǎng)商品分析 對(duì)市場(chǎng)上收集到的31份商品藥材提取DNA后一部分進(jìn)行MLPA-熔解反應(yīng)，比較分析所得到的熔解曲線峰；另一部分送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并與GeneBank中的序列對(duì)比，確認(rèn)其基源。16份五味子藥材出現(xiàn)(82.3±0.3) ℃的熔解曲線峰，15份南五味子藥材出現(xiàn)(80.7±0.3) ℃的熔解曲線峰，表明16份為五味子，15份為南五味子，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，表明本研究建立的方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)誤，根據(jù)Tm值能夠準(zhǔn)確的將五味子和南五味子區(qū)分開(kāi)。

3 討論

目前關(guān)于中藥材的DNA提取大多數(shù)基于DNA含量豐富的新鮮干燥葉片，然而在市場(chǎng)上流通以及供臨床使用的更多的是藥材，所以直接以藥材作為DNA提取的原料更為合適。五味子是一種果實(shí)類中藥，本課題組前期在DNA提取過(guò)程中，首先采用了試劑盒提取的方法，提取到的DNA濃度較低、質(zhì)量差，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16]，以種仁為提取材料，對(duì)比發(fā)現(xiàn)采用改良CTAB法得到的DNA質(zhì)量最佳。

我國(guó)的藥用植物品種繁多，基源復(fù)雜。近年來(lái)，因?yàn)檎`用混用造成中藥毒副事件常有發(fā)生，因而建立一種簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、易于操作的方法鑒定藥用植物基源確保臨床用藥安全至關(guān)重要。相比于性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別來(lái)說(shuō)，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、不易受環(huán)境因素和加工炮制方法的影響，受到了廣大研究者的青睞。目前雖已有學(xué)者利用ISSR[17-18]、RAPD[19-20]、DNA條形碼[12，21]等方法對(duì)南、北五味子進(jìn)行了鑒定，但這些方法在檢測(cè)速度和檢測(cè)準(zhǔn)確度方面存在一些局限性。

傳統(tǒng)的MLPA產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行結(jié)果分析，不僅費(fèi)時(shí)，而且將PCR產(chǎn)物取出過(guò)程中存在可能產(chǎn)生氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。為彌補(bǔ)傳統(tǒng)MLPA技術(shù)的不足，本研究引入熔解曲線分析，在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，將MLPA技術(shù)和熔解曲線相結(jié)合建立了一種快速鑒定五味子和南五味子的方法。選用ITS2序列作為擴(kuò)增片段，MLPA反應(yīng)基本步驟包括探針和目的序列 DNA 雜交、連接、PCR 擴(kuò)增，此方法的特異性體現(xiàn)在探針的設(shè)計(jì)上，每條探針包括兩個(gè)核苷酸片段，只有當(dāng)兩個(gè)片段完全與目的序列雜交互補(bǔ)后才能被連接酶連接成一條完整的序列，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，即使有一個(gè)堿基不匹配也會(huì)導(dǎo)致連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解，這兩個(gè)步驟只需一個(gè)熒光定量PCR儀就能完成，且在完成PCR過(guò)程之后，無(wú)需將樣品取出直接進(jìn)行熔解程序，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA雙鏈熔解過(guò)程中熒光信號(hào)的積累，就能直觀地看到DNA雙鏈熔解隨溫度變化曲線的差異，擴(kuò)增片段的堿基序列、片段長(zhǎng)度、GC含量都會(huì)對(duì)Tm值產(chǎn)生影響[22]，從而在不同的位置出現(xiàn)熔解曲線峰，以此將不同的物種區(qū)分開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩條探針長(zhǎng)度分別為113和110 bp，但是實(shí)際參與雜交的序列只有約60 bp，其余的為引物和填充序列，對(duì)樣品DNA的完整性要求低，即使DNA發(fā)生降解也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在不計(jì)算DNA提取時(shí)間的情況下，僅需要2～3 h就能完成至少16個(gè)樣品的鑒定，而且操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好。

通過(guò)MLPA技術(shù)結(jié)合熔解曲線能夠高效快速地將五味子和南五味子區(qū)分開(kāi)，在今后的研究中，可以嘗試將此方法應(yīng)用到含五味子的中成藥的檢測(cè)中，同時(shí)此研究也可以為其他中藥品種的MLPA鑒定提供參考。