吳亞菲，刁文婧，周鶴鳴，李琴

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080)

肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌主要的組織學(xué)亞型，以高復(fù)發(fā)、難治愈的特征成為全球第二大致死腫瘤[1]。肝癌治療指導(dǎo)原則建議[2-3]：早期肝癌患者優(yōu)選外科切除、肝移植及射頻消融等治療方式；對(duì)于疾病進(jìn)展期但肝功能尚可且無血道轉(zhuǎn)移的患者優(yōu)先選擇化療栓塞；對(duì)于無法進(jìn)行局部治療的患者，推薦采取以口服索拉非尼為代表的全身治療方式[4]。早期肝癌癥狀通常不明顯，當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)，大多數(shù)患者已發(fā)展至晚期。然而，晚期患者索拉非尼藥物治療效果不佳，索拉非尼耐藥后使用瑞戈非尼能在一定程度上延長患者生存期，但其療效依舊有限[5]。因此，尋找肝癌藥物治療的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)是含4個(gè)亞單位(A、B、C、D)的蛋白復(fù)合物，主要定位在線粒體內(nèi)膜上[6]。研究表明，SDH各個(gè)亞單位參與三羧酸循環(huán)及線粒體呼吸鏈。其中SDHA催化琥珀酸生成富馬酸；SDHB作為重要組分參與電子傳遞鏈中泛醌到泛醇的氧化過程；SDHC及SDHD主要協(xié)助SDH蛋白錨定在線粒體上，保證電子傳遞鏈工作井然有序。研究發(fā)現(xiàn)SDH各亞單位表達(dá)異常引起細(xì)胞代謝紊亂及腫瘤發(fā)生[7-9]；SDHD/PTEN/自噬軸參與調(diào)控甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展[10]；TGF-β/SDHD/HIF-1α軸影響骨肉瘤化療耐藥[11]。SDHD可能是調(diào)控腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要靶點(diǎn)。然而，SDHD在肝癌發(fā)展中的作用尚不明確。本研究旨在探究瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及對(duì)SDHD表達(dá)水平的影響，觀察SDHD對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、瑞戈非尼藥物作用及肝癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 瑞戈非尼(MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-10331，純度≥99.0%)；二甲亞砜(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：RNBF8134)；AKT信號(hào)通路激動(dòng)劑SC79(MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-10358，含量≥98.0%)；AKT信號(hào)通路抑制劑MK2206(MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-18749，含量≥99.0%)；胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)：10099-141)；青霉素-鏈霉素溶液(蘇州新賽美公司，批號(hào)：C100C5)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM，Gibco公司，批號(hào)：C11995500BT)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-K0301)；細(xì)胞增殖成像分析試劑盒(Edu試劑盒，銳博生物公司，批號(hào)：R11053.10)；凋亡試劑盒(聯(lián)科生物公司，批號(hào)：AP105)；Trizol裂解液(Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026)；RIPA裂解液(蘇州新賽美公司，批號(hào)：WB3100)；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液(蘇州新賽美公司，批號(hào)：P002)；轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基 Opti-MEM(Gibco公司，批號(hào)：31985070)；脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司，批號(hào)：11668-019)；抗體SDHD(CST公司，批號(hào)：#45849)；抗體AKT(CST公司，批號(hào)：4685)；抗體p-AKT(Ser473)(CST公司，批號(hào)：4060)；抗體β-actin(CST公司，批號(hào)：58169)；抗體GAPDH(CST公司，批號(hào)：97166)。

1.2設(shè)備與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司，型號(hào)：BB150)；酶標(biāo)儀(BIOTEK 公司，型號(hào)：ELX-800)；倒置熒光顯微鏡(Leica公司，型號(hào)：DMi8)；流式細(xì)胞儀(BD公司，型號(hào)：Accuri C6)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，型號(hào)：ABI QuantStudioTM6 Flex)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株Huh7購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，后由實(shí)驗(yàn)室保存。人肝癌細(xì)胞株Huh7培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，并在含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長達(dá)到約80%覆蓋率時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4轉(zhuǎn)染過表達(dá)(overexpression，OE)質(zhì)粒構(gòu)建SDHD過表達(dá)細(xì)胞模型 細(xì)胞鋪板及預(yù)處理：以6孔板為例，取狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞生長至40%～50%覆蓋率后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h換成轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基Opti-MEM進(jìn)行預(yù)處理。質(zhì)粒稀釋：以100 μL Opti-MEM稀釋OE質(zhì)粒(4 μL)和Lipofectamine 2000(4 μL)。轉(zhuǎn)染步驟：兩組稀釋液室溫靜置5 min后混勻，混合液室溫靜置15 min后加入6孔板中，6～8 h更換成正常培養(yǎng)基。48 h后收集細(xì)胞并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，獲得SDHD過表達(dá)細(xì)胞模型。OE-SDHD序列見表1。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒序列 Tab.1 Oligos used in the research

1.5轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)質(zhì)粒構(gòu)建SDHD敲減細(xì)胞模型 細(xì)胞鋪板及預(yù)處理同“1.4”。質(zhì)粒稀釋：以100 μL Opti-MEM稀釋siRNA(5 μL)和Lipofectamine 2000(5 μL)。轉(zhuǎn)染步驟同“1.4”。48 h后收集細(xì)胞驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，獲得SDHD敲減細(xì)胞模型。3組siRNA-SDHD序列見表1。

1.6CCK-8檢測細(xì)胞活性 為驗(yàn)證SDHD過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力的影響，將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(NC)及SDHD過表達(dá)組(OE)。為驗(yàn)證SDHD敲減對(duì)細(xì)胞活力的影響，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(ctr)及SDHD敲減組(si-2及si-3)。各組細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。24 h后棄去原始培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基100 μL，并繼續(xù)孵育2～4 h。孵育結(jié)束后在酶標(biāo)儀波長450 nm下檢測各孔吸光度(A)值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 為考察瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，將Huh7細(xì)胞鋪板并分為空白處理組和不同濃度(2，4，6，8，10 μmol·L-1)瑞戈非尼處理組，處理時(shí)間為24 h。為考察過表達(dá)SDHD對(duì)瑞戈非尼藥物作用下細(xì)胞凋亡的影響，分組為NC-control組、OE-control 組、NC-6 μmol·L-1組和OE-6 μmol·L-1組，其中NC-control組及OE-control 組均無藥物處理，NC-6 μmol·L-1組和OE-6 μmol·L-1組均給予6 μmol·L-1瑞戈非尼處理，處理時(shí)間為24 h。為考察MK2206對(duì)SDHD促瑞戈非尼作用下細(xì)胞凋亡的影響，分組為NC組、OE組、OE+SC79組和OE+MK2206組，其中NC組及OE組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼處理，OE+SC79組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼及5 μmol·L-1SC79處理，OE+MK2206組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼及10 μmol·L-1MK2206處理，處理時(shí)間為24 h。各組細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，消化離心收集細(xì)胞沉淀。隨后使用預(yù)冷的流式緩沖液重懸，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Ep管中，加入凋亡試劑盒中的凋亡染料混勻后避光染色15 min。染色結(jié)束后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。通過計(jì)算早期凋亡率與晚期凋亡率的總和分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting，WB)檢測蛋白表達(dá) 為檢測瑞戈非尼對(duì)SDHD蛋白表達(dá)水平的影響，Huh7細(xì)胞鋪板后分為空白處理組及6 μmol·L-1瑞戈非尼處理組，經(jīng)24 h及48 h分別處理后收集細(xì)胞樣品。為檢測SDHD過表達(dá)細(xì)胞模型中SDHD、AKT及p-AKT(Ser473)的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)分為NC組及OE組。為檢測SDHD敲減細(xì)胞模型中SDHD、AKT及p-AKT(Ser473)的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)分組為ctr組、si-1組、si-2組及si-3組。細(xì)胞收樣后經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩遍，使用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液的RIPA裂解后離心獲得蛋白上清液。取樣品蛋白30 μg，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯影操作，使用ImageJ軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為空白處理組及6 μmol·L-1瑞戈非尼處理組，經(jīng)24 h及48 h分別處理后獲取細(xì)胞樣品。細(xì)胞樣品首先經(jīng)Trizol裂解液裂解，依次加入三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇處理后獲得RNA溶液并定量。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，并以cDNA模板進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物均由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如表2。

表2 RT-qPCR引物序列 Tab.2 Primer sequence of RT-qPCR

1.10Edu試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)分組同“1.6”項(xiàng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Edu試劑盒說明書進(jìn)行Edu染色2 h。染色結(jié)束后去除染色液，PBS輕柔清洗后加入細(xì)胞固定液室溫孵育30 min，經(jīng)PBS清洗后加入含0.5% TritonX-100的PBS孵育10 min。孵育結(jié)束后PBS清洗一次，隨后加入1X Apollo?反應(yīng)液孵育30 min，PBS清洗并加入Edu試劑盒中的1×Hoechst33342 反應(yīng)液繼續(xù)染色。染色結(jié)束后于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，記錄陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率為每視野下紅色熒光數(shù)與藍(lán)色熒光數(shù)比值。陽性細(xì)胞率越高，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.11GEPIA分析肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達(dá)的相關(guān)性 首先搜索并打開GEPIA在線工具(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，點(diǎn)擊選擇“Multiple Gene Analysis”，然后選擇“Correlation Analysis”。依次填寫基因“SDHD”及“AKT1”“TCGA Tumor” 項(xiàng)選擇“LIHC Tumor”并添加到“Used Expression Datasets”中。最后點(diǎn)擊“Plot”輸出結(jié)果，分析肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.12Kaplan Meier-plotter 分析SDHD mRNA表達(dá)與肝癌預(yù)后的相關(guān)性 首先進(jìn)入Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站(http：//kmplot.com/analysis)，點(diǎn)擊“Start KM Plotter for liver cancer”進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置頁面。然后在“Affy id/Gene symbol”對(duì)話框中輸入“SDHD”，“Survival”分別選擇“OS”“RFS”，其余選項(xiàng)維持默認(rèn)值。點(diǎn)擊“Draw Kaplan-Meier Plot”輸出結(jié)果，分析SDHD的mRNA表達(dá)水平與肝癌患者總生存期(OS)及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間(RFS)的相關(guān)性。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。對(duì)于兩組之間差異比較，采用t檢驗(yàn)。對(duì)于多組間差異比較采用單因素方差分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及SDHD表達(dá)的影響 見圖1。流式結(jié)果顯示，與空白處理組相比，4，6，8，10 μmol·L-1瑞戈非尼處理組細(xì)胞凋亡率均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1A-B)。此外，與空白處理組相比，6 μmol·L-1瑞戈非尼24 h 48 h給藥處理均能促進(jìn)SDHD mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05，見圖1C-D)。以上結(jié)果提示SDHD可能在瑞戈非尼藥物作用下的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

A&B.不同濃度瑞戈非尼對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響；C.瑞戈非尼24 h及48 h給藥對(duì)SDHD mRNA表達(dá)的影響；D.瑞戈非尼24 h及48 h給藥對(duì)SDHD蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；①P<0.01；②P<0.05。圖1 瑞戈非尼對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡及SDHD表達(dá)水平的影響A&B.Effect of different concentrations of regorafenib on cell apoptosis of Huh7；C.Effect of 24 h or 48 h regorafenib treatment on mRNA level of SDHD；D.Effect of 24 h or 48 h regorafenib treatment on protein level of SDHD；①P<0.01；②P<0.05。Fig.1 The effect of regorafenib on cell apoptosis and SDHD expression in

2.2構(gòu)建SDHD過表達(dá)及敲減細(xì)胞模型 WB結(jié)果顯示，OE組SDHD表達(dá)水平高于NC組(t=3.603，P<0.05，見圖2A)，說明SDHD過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。si-1、si-2和si-3組SDHD表達(dá)水平均低于ctr組(P<0.05，見圖2B)，說明SDHD敲減細(xì)胞模型構(gòu)建成功，且si-2和si-3敲減效果更為理想，后續(xù)使用si-2及si-3驗(yàn)證SDHD敲減對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

A.WB驗(yàn)證SDHD過表達(dá)效率；B.WB驗(yàn)證SDHD敲減效率；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001。圖2 構(gòu)建SDHD過表達(dá)和敲減細(xì)胞模型A.The efficiency of SDHD over expression was validated by WB；B.The efficiency of SDHD knockdown was valdated by WB；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001。Fig.2 Construction of SDHD overexpression model and SDHD knockdown

2.3SDHD對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，OE組細(xì)胞活力降低(t=4.243，P<0.05，見圖3A)；與ctr組比較，si-2及si-3組細(xì)胞活力均增高(P<0.05，見圖3A)。Edu實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OE組Edu陽性細(xì)胞率低于NC組(t=6.736，P<0.05，見圖3B，3D)，si-2及si-3組陽性細(xì)胞率均高于ctr組(P<0.05，見圖3C，3E)。以上數(shù)據(jù)結(jié)果提示過表達(dá)SDHD 抑制細(xì)胞增殖，敲減SDHD促進(jìn)細(xì)胞增殖。

A.CCK-8檢測SDHD對(duì)Huh7細(xì)胞活力的影響；B&D.Edu實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)SDHD對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響；C&E.Edu實(shí)驗(yàn)檢測敲減SDHD對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1。圖3 SDHD對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響A.Effect of SDHD on the viability of Huh7 cell was quantified by CCK-8；B&D.Effect of SDHD knockdown on the proliferation of Huh7 cell was quantifitecl by Edu；C&E.Effect of SDHD knockdown on the proliferation of Huh7 cell was quantifiecl by Edu；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1.Fig.3 Effect of SDHD on Huh7

2.4過表達(dá)SDHD對(duì)瑞戈非尼藥物作用下細(xì)胞凋亡的影響 流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NC-control組與OE-control組細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)，但OE-6 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率高于NC-6 μmol·L-1(P<0.05)，見圖4A-B。這一結(jié)果提示過表達(dá)SDHD不影響細(xì)胞基礎(chǔ)凋亡率，但能提高細(xì)胞在瑞戈非尼作用下的凋亡率。

A&B.流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)SDHD對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；①P<0.000 1。圖4 過表達(dá)SDHD對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡率的影響(n=3) A&B.Effect of SDHD overexpresion on cell apoptosis of Huh7 was analyzed by flow cytometry ；①P<0.000 1。Fig.4 Effect of SDHD overexpression on the apoptosis rate in Huh7(n=3)

2.5MK2206對(duì)SDHD促瑞戈非尼作用下細(xì)胞凋亡的影響 AKT信號(hào)通路參與肝癌增殖、遷移、侵襲及耐藥過程[12-14]，對(duì)于肝癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后具有重要意義。為明確SDHD對(duì)肝癌細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響，本研究對(duì)p-AKT(Ser473)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。WB結(jié)果顯示，OE組 p-AKT(Ser473)表達(dá)高于NC組(P<0.05，見圖5A)；si-1、si-2和si-3組p-AKT(Ser473)表達(dá)均低于ctr組(P<0.05，見圖5B)。以上數(shù)據(jù)提示SDHD能通過提高p-AKT(Ser473)的表達(dá)水平激活A(yù)KT信號(hào)通路。

隨后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析AKT信號(hào)通路抑制劑MK2206對(duì)SDHD促瑞戈非尼作用下細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與OE組比較，OE+MK2206組細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增多(P<0.000 1)，而OE+SC79組的細(xì)胞凋亡與OE組無明顯差異，見圖5C-D。以上結(jié)果提示MK2206能夠協(xié)同SDHD過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞在瑞戈非尼作用下發(fā)生凋亡。此外，通過GEPIA網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫分析SDHD與AKT1基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肝癌腫瘤組織中SDHD與AKT1表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，R=0.33，見圖5E)，隨著SDHD的表達(dá)增多，AKT1的表達(dá)也隨之增加。

A.過表達(dá)SDHD對(duì)AKT信號(hào)通路的影響；B.敲減SDHD對(duì)AKT信號(hào)通路的影響；C&D.流式細(xì)胞術(shù)檢測SC79和MK2206對(duì)SDHD促瑞戈非尼藥物作用的影響；E.肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達(dá)的相關(guān)性；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1。圖5 觀察SDHD對(duì)AKT信號(hào)通路的影響A.Effect of SDHD overexpression on AKT signaling pathway；B.Effect of SDHD knockdown on AKT signaling pathway；C&D.Effect of SC79 or MK2206 on the promotion of SDHD in regorafenib-related apptosis was analyzed by flow cyrometry；E.Correlation between SDHD and AKT1 gene expression in liver concer；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1.Fig.5 The effect of SDHD on AKT signaling

2.6SDHD mRNA表達(dá)水平與肝癌臨床預(yù)后的關(guān)系 通過分析Kaplan Merier-plotter網(wǎng)站的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SDHD患者組的總生存期(overall survival，OS)及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間(recurrence free survival，RFS)長于低表達(dá)SDHD患者組(P<0.05，見圖6A-B)，提示高表達(dá)SDHD的肝癌患者預(yù)后更好。

A.SDHD表達(dá)與肝癌患者OS的相關(guān)性；B.SDHD表達(dá)與肝癌患者RFS的相關(guān)性。圖6 SDHD表達(dá)高低與肝癌臨床預(yù)后的關(guān)系 A.Representatior of overall survival depending on SDHD expression in patients with liver cancer；B.Representation of recurrence free survival depending on SDHD expression in patients with liver cancer.Fig.6 Relationship between SDHD and clinical prognosis in HCC

3 討論

肝細(xì)胞癌是高復(fù)發(fā)、難治愈的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為18%。晚期肝癌的首選治療藥物索拉非尼雖然具有一定的臨床療效，但耐藥的出現(xiàn)給肝癌治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)表明索拉非尼耐藥后采用瑞戈非尼進(jìn)行治療能夠在一定程度上提高肝癌患者的總生存期[15]。但隨著研究進(jìn)一步深入，瑞戈非尼耐藥問題也日漸凸顯：SphK2/S1P通過激活NF-κB和STAT3介導(dǎo)肝癌瑞戈非尼耐藥[16]；ADAMTSL5作為主要的調(diào)節(jié)因子參與肝癌瑞戈非尼耐藥[17]。因此，繼續(xù)挖掘肝癌治療的新靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

SDHD作為琥珀酸脫氫酶復(fù)合體中的關(guān)鍵亞單位，通過影響PTEN-AKT-FOXO3a軸參與甲狀腺癌的腫瘤調(diào)控過程[10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道SDHD參與TGF-β介導(dǎo)的骨肉瘤化療耐藥：TGF-β引起SDHD表達(dá)下調(diào)，并通過上調(diào)HIF-1α引起骨肉瘤化療耐藥[11]。然而，SDHD在肝癌中的作用尚未完全闡明。本研究通過驗(yàn)證瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及SDHD表達(dá)的影響，探索SDHD對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及瑞戈非尼藥物作用的影響，提示SDHD或許是肝癌治療的新靶點(diǎn)。

肝癌細(xì)胞的增殖能力與藥物作用下的細(xì)胞凋亡水平在一定程度預(yù)示著腫瘤的生長及藥物治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)瑞戈非尼在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中引起SDHD表達(dá)上調(diào)，提示SDHD可能是瑞戈非尼刺激下的積極響應(yīng)因子。隨后發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SDHD抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)提高細(xì)胞在瑞戈非尼藥物作用下的凋亡率。結(jié)合臨床大數(shù)據(jù)分析SDHD與肝癌患者總生存期及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SDHD的肝癌患者預(yù)后更好，提示SDHD發(fā)揮抑癌因子的作用。

AKT信號(hào)通路參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移、耐藥及復(fù)發(fā)過程，是經(jīng)典的腫瘤信號(hào)通路[18-20]。AKT存在2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為Thr 308位點(diǎn)及Ser 473位點(diǎn)。AKT被磷酸化激活后促使一系列底物磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長及代謝過程[21，22]。文獻(xiàn)報(bào)道瑞戈非尼處理能夠激活肝癌細(xì)胞AKT信號(hào)通路，瑞戈非尼聯(lián)合駱駝蓬堿能夠通過抑制AKT信號(hào)通路進(jìn)一步殺傷細(xì)胞[23]。此外，結(jié)腸癌細(xì)胞瑞戈非尼耐藥株在瑞戈非尼刺激后激活A(yù)KT信號(hào)通路[24]；瑞戈非尼誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞富集及耐藥依賴于AKT/FOXM1/STMN1 信號(hào)通路的激活[25]。以上文獻(xiàn)提示瑞戈非尼刺激引起AKT信號(hào)通路激活，瑞戈非尼耐藥與AKT信號(hào)通路激活之間存在十分重要的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)瑞戈非尼刺激引起肝癌細(xì)胞SDHD表達(dá)增多，隨后通過WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源過表達(dá)SDHD提高p-AKT(Ser473)的表達(dá)，而敲減SDHD降低p-AKT(Ser473)的表達(dá)，這表明SDHD能通過磷酸化AKT激活該信號(hào)通路。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AKT信號(hào)通路激動(dòng)劑不影響SDHD過表達(dá)對(duì)瑞戈非尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，這可能是由于SDHD已經(jīng)激活了AKT信號(hào)通路，在此基礎(chǔ)上再次激活A(yù)KT信號(hào)通路則不會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；反之，抑制AKT通路能夠協(xié)同SDHD過表達(dá)進(jìn)一步提高細(xì)胞在瑞戈非尼作用下的凋亡水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)瑞戈非尼促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，提高SDHD的表達(dá)水平，過表達(dá)SDHD能抑制肝癌細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞在瑞戈非尼作用下的凋亡水平。SDHD可能是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。