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        基于Cu2O/AuNPs構(gòu)建電流型免疫傳感器檢測載脂蛋白A1

        2022-12-08 05:41:50張強(qiáng)艷齊繼蘭張曉蕾吳春勇劉元華楊功俊
        關(guān)鍵詞:膀胱癌反應(yīng)時(shí)間電化學(xué)

        張強(qiáng)艷, 齊繼蘭, 薛 穎, 孟 飛, 張曉蕾, 吳春勇, 劉元華, 楊功俊*

        (1. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院, 南京 210009; 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院江蘇省腫瘤醫(yī)院, 南京 210009)

        膀胱癌是男性人群中常見的發(fā)生于尿道組織的腫瘤, 具有較差的愈后和較高的病死率[1].目前其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確, 所以早期診斷和愈后檢查對于膀胱癌尤為重要[2].臨床上常用于膀胱癌的診斷技術(shù)是膀胱鏡組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢查,具有創(chuàng)傷性、費(fèi)時(shí)及費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)[3].腫瘤標(biāo)志物是反映腫瘤發(fā)生發(fā)展情況的一種物質(zhì),對其不斷地研究與發(fā)現(xiàn)為腫瘤的早期診斷和治療提供了新思路[4].利用雙向凝膠電泳及質(zhì)譜等方法,研究者發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1(apolipoprotein-A1, Apo-A1) 在膀胱癌患者尿液中的濃度相對較高, 并與酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 檢測結(jié)果一致, 因此可將其作為膀胱癌的一種腫瘤標(biāo)志物[5].目前常用于Apo-A1的檢測方法有酶聯(lián)免疫法 (ELISA)[6]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)[7]、電化學(xué)生物傳感器[8]等.電化學(xué)免疫傳感器具有操作簡便、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn), 為蛋白質(zhì)的檢測提供更便捷的方法[9].金屬納米材料因具有較強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移能力、較大的比表面積、優(yōu)異的電催化作用及生物相容性而備受分析工作者的關(guān)注[10], 目前已有許多金屬及金屬氧化物等納米材料如Cu2O[11]、Pd@AuNPs[12]、Fe3O4[13]等用于電化學(xué)免疫傳感器的制備.其中, Cu2O因具有良好的電氧化還原信號而應(yīng)用廣泛[14], 且AuNPs具有良好的生物親和力,分散性好, 因此常被分散于復(fù)合納米材料中構(gòu)建性能優(yōu)異的免疫傳感器[15-16].本文采用在氧化亞銅納米立方體表面原位還原Au3+制得氧化亞銅/金納米顆粒(Cu2O/AuNPs)復(fù)合材料構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器, 利用Cu2O中銅元素的氧化峰電流在免疫反應(yīng)前后的變化實(shí)現(xiàn)Apo-A1的快速檢測,并成功用于實(shí)際樣品分析.

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CHI 660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司,中國)進(jìn)行, 采用三電極體系: 玻碳電極(GCE, 直徑3 mm)及其修飾電極為工作電極, 鉑絲電極為對電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極.Cu2O/AuNPs復(fù)合物的形貌通過Quanta 250 FEG場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI公司, 美國)進(jìn)行表征, Cu2O的XRD由D8Advance多晶X射線衍射儀(Burker-AXS公司, 德國)進(jìn)行表征.實(shí)驗(yàn)在(25±0.5) ℃條件下進(jìn)行.

        人源Apo-A1生物素抗體(Ab), 重組人源Apo-A1抗原均購自Abcam(中國上海); 五水硫酸銅, 抗壞血酸, 四水氯金酸(上海國藥試劑有限公司, 中國); 氫氧化鈉(廣東西隴科學(xué)股份有限公司, 中國).其他試劑均為分析純, 溶液均由二次蒸餾水配制.

        1.2 Cu2O/AuNPs的制備

        1.3 免疫傳感器的制備

        圖1 Cu2O/AuNPs的合成及電化學(xué)傳感器的制備Fig.1 The synthesis procedure of the Cu2O/AuNPs and the preparation of the electrochemical immunosensor

        1.4 Apo-A1的測定

        將制得的免疫傳感器與不同濃度的Apo-A1在37.5 ℃下孵育130 min后, 用0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)充分清洗以除去未發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的Apo-A1.將傳感器置于一定體積的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)溶液中進(jìn)行示差脈沖伏安掃描,記錄氧化峰電流, 依據(jù)Cu2O氧化峰電流在免疫反應(yīng)前后的變化實(shí)現(xiàn)Apo-A1的檢測.

        1.5 實(shí)際樣品的制備

        本實(shí)驗(yàn)從江蘇省腫瘤醫(yī)院獲得多次膀胱切除術(shù)后患者的血清和惡性膀胱腫瘤個(gè)人史患者的尿液樣品.血清和尿液樣品均用20倍體積的0.1 mol·L-1PBS (pH=7.4)稀釋, 離心15 min(10 000 rpm)并靜置15 min后收集上層清液, 并于4 ℃冰箱中保存.

        2 結(jié)果與討論

        2.1 Cu2O/Au納米復(fù)合材料的表征

        圖2 Cu2O(a~b)和Cu2O/AuNPs(c)的SEM圖, Cu2O 的XRD圖(d)和EDX能譜圖(e~h)Fig.2 SEM image of Cu2O(a~b) and Cu2O/AuNPs(c), XRD of Cu2O(d), EDX mapping (e~g) and spectrum (h) of Cu2O/AuNPs

        2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

        a. 裸GCE; b. Cu2O/AuNPs/GCE; c. CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; d. Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; e. BSA/Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE; f. Apo-A1/BSA/Ab/GA/CHIT/Cu2O/AuNPs/GCE圖3 (a) 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖譜; 阻抗Nyquist圖(插圖為擬合阻抗譜的Randles等效電路); (c) 不同修飾電極在0.1 mol·L-1 PBS (pH=7.4)中的循環(huán)伏安曲線.Fig.3 (a) Electrochemical impedance patterns of different modified electrodes; (b) Nyquist plots of impedance spectra, the inset is the equivalent circuit applied to fit the impedance spectra in the presence of the redox probe of 5 (c) Cycle voltammetry of immune process in 0.1 mol·L-1 PBS (pH=7.4).

        表1 免疫傳感器通過Randles等效電路擬合參數(shù)Tab.1 The parameters of immune sensor fitted by Randles equivalent circuit

        2.3 條件優(yōu)化

        為了進(jìn)一步優(yōu)化電化學(xué)免疫傳感器的性能,探討了介質(zhì)的pH值,反應(yīng)溫度和抗原抗體反應(yīng)時(shí)間對免疫反應(yīng)的影響.圖4(a)為不同pH值對免疫反應(yīng)前后電流強(qiáng)度變化的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)介質(zhì)的pH達(dá)到7.4時(shí),免疫反應(yīng)前后電流降低的變化值達(dá)到最大,故本實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.4的介質(zhì)進(jìn)行檢測.圖4(b)為反應(yīng)溫度對電流變化的影響.結(jié)果表明,當(dāng)免疫反應(yīng)溫度為37.5 ℃時(shí)電流的變化最大.圖4(c)為抗原抗體反應(yīng)時(shí)間對電流變化的影響.從圖4(c)可以看出,當(dāng)免疫反應(yīng)時(shí)間小于120 min時(shí), 隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的延長,電流逐漸增大;當(dāng)免疫反應(yīng)時(shí)間大于120 min時(shí), 電流達(dá)到最大且基本保持不變,所以選擇孵育時(shí)間為130 min.

        圖4 介質(zhì)pH(a)、反應(yīng)溫度(b)和反應(yīng)時(shí)間(c)對免疫反應(yīng)前后電流變化的影響Fig.4 The effect of (a) medium pH, (b) temperature and (c) incubation time on the change of current intensity with 1.00 μg·mL-1 Apo-A1

        2.4 線性范圍和檢測限

        圖5 (a)不同濃度Apo-A1的示差脈沖伏安圖(a~h: 0, 10.0, 100, 1.00×103, 1.00×104, 1.00×105, 1.00×106, 1.00×107 pg·mL-1); (b) 電流強(qiáng)度變化值與Apo-A1濃度的關(guān)系(n=3).Fig.5 DPV curves (a) and the linear relationship (b) of the immunosensors incubated with different concentration of Apo-A1(n=3)

        2.5 電極的重復(fù)性、穩(wěn)定性和選擇性研究

        在最佳實(shí)驗(yàn)條件下, 對同一個(gè)電極采用相同的方法制備5次,其電流強(qiáng)度變化值的RSD為3.3%; 采用相同的方法制備5根免疫傳感器,其電流強(qiáng)度變化值的RSD為4.5%,表明該傳感器具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性.將免疫傳感器在4 ℃下放置10 d后, 其電流響應(yīng)值為初始值的90%, 說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性.

        傳感器的選擇性通過將一定濃度的Apo-A1與5倍濃度的干擾蛋白(如Ig G, CEA)混合孵育, 其電流值變化與僅含Apo-A1的傳感器進(jìn)行比較,得到干擾蛋白引起的電流值變化小于5%,說明該傳感器具有良好的選擇性.

        3 實(shí)際樣品測定

        按照1.5節(jié)的方法對樣品進(jìn)行前處理后,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,對樣品溶液重復(fù)測定3次,結(jié)果如表3所示.表3結(jié)果顯示,本文方法的樣品回收率在97.37%~110.9%范圍內(nèi), 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于4.2%, 表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性,有望應(yīng)用于實(shí)際樣品中Apo-A1的檢測.

        表3 實(shí)際樣品中Apo-A1回收率測定Tab.3 The recovery of Apo-A1 in real samples

        4 結(jié)論

        本研究首次將重組Apo-A1 抗體成功地固定在Cu2O/AuNPs 納米復(fù)合材料表面, 并制備電流型免疫傳感器,成功建立了測定Apo-A1 的電化學(xué)方法.該免疫傳感器具有較寬的線性范圍、良好的重復(fù)性、選擇性和穩(wěn)定性, 并成功用于實(shí)際樣品的檢測,將為膀胱癌的診斷提供新的思路.

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