張亞偉 田博雅 王月紅 劉 強(qiáng) 張?jiān)獞c

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，晉中 030801)

短鏈有機(jī)酸主要包括乳酸和揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)等，廣泛存在于反芻動(dòng)物前胃以及其他草食動(dòng)物和包括人在內(nèi)的雜食動(dòng)物的后腸道內(nèi)，主要由消化道微生物通過利用碳水化合物進(jìn)行混合酸發(fā)酵而產(chǎn)生。其中，VFA是分子中包含1～7個(gè)碳原子的直鏈或支鏈脂肪酸的統(tǒng)稱，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等。據(jù)報(bào)道，這些短鏈有機(jī)酸能夠分別為反芻動(dòng)物、人或其他雜食動(dòng)物和草食動(dòng)物提供約70%、10%和20%～30%的能量需要[1]。在這些短鏈有機(jī)酸中，乙酸、丙酸和丁酸是微生物發(fā)酵碳水化合物的主要產(chǎn)物，約占正常生理狀態(tài)下腸道內(nèi)容物中短鏈有機(jī)酸的95%，也是宿主尤其是反芻動(dòng)物可利用代謝能的主要形式[1]。戊酸主要由乙酸和丙酸縮合而成，而支鏈VFA如異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸，則主要由蛋白降解菌利用支鏈氨基酸通過脫氨基作用而產(chǎn)生，它們?cè)谀c道短鏈有機(jī)酸中的占比通常不超過5%[1]。甲酸雖然也是腸道微生物混合酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物之一，但它是產(chǎn)甲烷菌的主要發(fā)酵底物，常以中間產(chǎn)物的形式參與腸道甲烷生成作用[2]。乳酸主要由乳酸菌進(jìn)行混合酸發(fā)酵產(chǎn)生，其在正常的腸道內(nèi)環(huán)境中濃度通常并不高，但在適宜乳酸菌生長(zhǎng)的低pH的腸道內(nèi)環(huán)境中，其濃度會(huì)迅速累積，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致反芻動(dòng)物瘤胃急性酸中毒[3]。此外，短鏈有機(jī)酸尤其是VFA還會(huì)影響上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、宿主血液流速以及腸道正常的分泌和吸收功能，甚至可能間接影響膽固醇合成以及胰島素和胰高血糖素的分泌[1]。因此，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定腸道內(nèi)容物中短鏈有機(jī)酸濃度，對(duì)研究動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和代謝過程，以及腸道甲烷生成作用乃至代謝性疾病均具有重要意義。

目前，腸道內(nèi)容物中短鏈有機(jī)酸濃度的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[4-6]、離子色譜法[7-8]、氣相色譜法[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、核磁共振波譜法[13-14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]等。傳統(tǒng)的蒸餾滴定法由于選擇性差、檢測(cè)效率低，目前已很少使用[12]；也有研究者使用拉曼光譜檢測(cè)VFA，但該方法目前能夠測(cè)定的VFA種類十分有限[16]。氣相色譜法靈敏度和分辨率高、重現(xiàn)性好，是目前最為常用的VFA定量方法；但直接氣相色譜法僅能測(cè)定乙酸等揮發(fā)性較強(qiáng)的酸，對(duì)于甲酸和乳酸則很難直接檢測(cè)，需要進(jìn)行衍生化處理，而衍生化處理則會(huì)導(dǎo)致誤差來源增加，結(jié)果重現(xiàn)性變差，且所用的衍生化試劑還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[12]。離子色譜法靈敏度高、重現(xiàn)性好，且能同時(shí)測(cè)定乳酸和多種VFA，但離子色譜儀依賴性較強(qiáng)，價(jià)格相對(duì)較為昂貴，普適性較差。毛細(xì)管電泳法前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、靈敏度好、檢出限也可滿足實(shí)際需要，但其對(duì)試劑純度的要求非常高，且電解質(zhì)的選擇相對(duì)較為復(fù)雜[12]。核磁共振波譜法無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，方法靈活且無偏向性，但其靈敏度較低，動(dòng)態(tài)范圍有限，且儀器維護(hù)和運(yùn)行成本更為高昂，普適性更差[13-14]。液相色譜靈敏度高、線性范圍較寬、重現(xiàn)性好，能夠分析70%以上的有機(jī)物，且正常條件下色譜柱可長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)利用，樣品前處理也較為簡(jiǎn)單[14]。然而，傳統(tǒng)的液相色譜對(duì)乳酸和部分VFA的分離度較差，且目前尚沒有全面地同時(shí)分析腸道內(nèi)容物中乳酸、甲酸和常見的VFA的研究報(bào)道。

以聚合樹脂(如聚苯乙烯-二乙烯基苯)為填料的色譜柱可基于配體交換反應(yīng)來保留和有效地分離含有醇羥基或羧基的碳水化合物，如糖、醇和有機(jī)酸等。該類色譜柱對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單，可在標(biāo)準(zhǔn)的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)系統(tǒng)中運(yùn)行，且流動(dòng)相僅使用純水或稀酸即可。因此，本研究擬利用配體交換柱基于高效液相色譜儀建立一種同時(shí)測(cè)定腸道內(nèi)容物中乳酸和甲酸等8種動(dòng)物消化道常見有機(jī)酸濃度的外標(biāo)分析方法，并使用瘤胃液為樣品對(duì)所建方法進(jìn)行檢驗(yàn)，以期為研究營養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物腸道中的消化吸收以及腸道甲烷生成乃至代謝性疾病提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

安捷倫高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity Ⅱ，安捷倫科技有限公司，德國)，配備G7129A型自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱模塊、G7111A型四元梯度泵和在線脫氣機(jī)模塊、Hi-Plex H配體交換色譜柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)、G7114A型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、OpenLAB CDS ChemStation型色譜工作站。ELGA LabWater超純水制備儀(PURELAB Ultra Genetic，威立雅水處理技術(shù)有限公司，英國)。高速冷凍離心機(jī)(AXTGL20M，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國)。奧豪斯電子天平(OHAUS AR1140，奧豪斯公司，美國)。

1.2 試劑與腸道內(nèi)容物樣品

甲酸(99%)、乙酸(99.8%)、丙酸(99.5%)、異丁酸(99.5%)、丁酸(99.5%)、異戊酸(99.0%)和戊酸(99.5%)對(duì)照品均為優(yōu)級(jí)純，購自上海麥克林生化科技有限公司；BePure乳酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度90.2%)購自北京曼哈格生物科技有限公司；偏磷酸購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；濃硫酸購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。腸道內(nèi)容物樣品選用瘤胃液，于晨飼后3 h采集自裝有永久性瘤胃瘺管的晉南牛(體重約350 kg)，冰水浴后5 400 r/min轉(zhuǎn)速下4 ℃低溫離心10 min，取上清液使用液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件的考察與篩選

使用電子天平和移液槍通過減重法準(zhǔn)確稱取0.042 2 g甲酸、0.534 0 g乙酸、0.607 7 g丙酸、0.058 5 g異丁酸、0.237 0 g丁酸、0.058 8 g異戊酸、0.073 1 g戊酸和0.070 2 g乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)移至盛有0.005 mmol/L硫酸溶液的100 mL容量瓶中，定容，配制成乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度分別為7.029 4、9.076 3、88.748 0、81.622 8、6.606 2、26.763 7、5.699 8和7.121 8 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液A。隨后，以混標(biāo)液A(混標(biāo)液A)為檢測(cè)對(duì)象，分別考察流動(dòng)相濃度、柱溫和流速對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品中各有機(jī)酸組分分離效率和檢測(cè)靈敏度的影響。其中硫酸流動(dòng)相的濃度分別選用0.005和0.010 mol/L；柱溫設(shè)置55、60和65 ℃ 3個(gè)梯度；流速分別選用0.5、0.6和0.7 mL/min。

1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

由于腸道內(nèi)容物中蛋白質(zhì)等大分子化合物濃度較高，為防止這些物質(zhì)阻塞色譜系統(tǒng)，通常需要進(jìn)行預(yù)處理。因此依據(jù)本課題組多年來的經(jīng)驗(yàn)和前人相關(guān)研究，本方法按照生物樣品預(yù)處理流程，使用25%的偏磷酸溶液進(jìn)行預(yù)處理，具體操作方法為：將混標(biāo)液A以體積比5∶1的比例同25%偏磷酸溶液混合，冷凍24 h，解凍后在4 ℃下12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液使用0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。此外，本試驗(yàn)同時(shí)以未作預(yù)處理的混標(biāo)液A為對(duì)照，以考察預(yù)處理方案是否對(duì)待測(cè)有機(jī)酸組分產(chǎn)生干擾。上機(jī)檢測(cè)采用經(jīng)步驟1.3優(yōu)化后的色譜條件，即流動(dòng)相選用0.005 mol/L硫酸溶液、進(jìn)樣量20 μL、柱溫60 ℃、流速0.7 mL/min。隨后連續(xù)進(jìn)樣6針，以考察色譜系統(tǒng)的重現(xiàn)性。

1.5 線性、定量限和檢測(cè)限

準(zhǔn)確移取不同體積的混標(biāo)液A，使用0.005 mol/L硫酸溶液逐級(jí)進(jìn)行梯度濃度稀釋，配制成不同濃度的混標(biāo)液用于線性測(cè)試，色譜條件同1.4。此外，為了評(píng)價(jià)添加偏磷酸對(duì)待測(cè)有機(jī)酸線性是否有影響，對(duì)于不同濃度的線性測(cè)試混標(biāo)液，本研究同時(shí)按照1.4所述方法進(jìn)行預(yù)處理作為試劑對(duì)照。

同時(shí)，為了確定各待測(cè)有機(jī)酸的定量限和檢測(cè)線，將混標(biāo)液A進(jìn)行梯度濃度稀釋，至每種有機(jī)酸色譜峰的信噪比分別達(dá)到10±2和3±1，分別作為各待測(cè)有機(jī)酸組分的定量限和檢測(cè)限。隨后，以峰面積為橫坐標(biāo)，以各待測(cè)有機(jī)酸的摩爾濃度為縱坐標(biāo)，以各待測(cè)有機(jī)酸在混標(biāo)液A及處于定量限時(shí)混標(biāo)稀釋液中的濃度和峰面積分別為上、下限進(jìn)行線性擬合，獲得各有機(jī)酸線性回歸方程及相應(yīng)的決定系數(shù)。

1.6 混標(biāo)液中有機(jī)酸的穩(wěn)定性和方法的精密度

混標(biāo)液中各有機(jī)酸的穩(wěn)定性通過在室溫狀態(tài)下同一混標(biāo)液在不同存放時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的各有機(jī)酸組分保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)選用1.4中混標(biāo)液A的50%濃度線性測(cè)試液，經(jīng)25%的偏磷酸預(yù)處理后，分別于0、6、12、18、24、48和72 h進(jìn)樣測(cè)定，預(yù)處理方法和色譜條件同1.4。

方法的精密度采用重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。以1.2中所采晉南牛瘤胃液為供試品，取3 mL解凍后的瘤胃液樣品6份，分別添加0.6 mL(體積比5∶1)25%偏磷酸溶液，充分混勻后冷凍24 h。解凍后在4 ℃下12 000 r/min低溫離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作為重復(fù)性試驗(yàn)待測(cè)溶液，采用與1.4相同的色譜條件上機(jī)檢測(cè)，通過保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來衡量方法的精密度。

1.7 方法的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

方法的準(zhǔn)確度采用加標(biāo)回收率試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。以1.2中所采晉南牛瘤胃液為供試品，首先通過1.5所得各待測(cè)有機(jī)酸的峰面積和1.4所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算瘤胃液中各有機(jī)酸濃度，然后利用減量法精確稱取適量各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成約為瘤胃液各有機(jī)酸濃度的60%、100%和140%的混標(biāo)液B、C和D。隨后，將瘤胃液樣品分別與混標(biāo)液B、C和D等體積混合配制成加標(biāo)樣液，按照1.5中重復(fù)性試驗(yàn)所述方法進(jìn)行預(yù)處理后上機(jī)檢測(cè)，色譜條件同1.4。最后按照下式計(jì)算各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率：

某有機(jī)酸的加標(biāo)回收率(%)=[(加標(biāo)試樣中該有機(jī)酸濃度實(shí)測(cè)值-供試瘤胃液中該有機(jī)酸濃度)/混標(biāo)液中該有機(jī)酸濃度]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化與篩選

對(duì)比不同色譜條件下混標(biāo)液中各有機(jī)酸組分的色譜圖(圖1)結(jié)果顯示，流動(dòng)相濃度和柱溫對(duì)各有機(jī)酸的出峰時(shí)間、峰面積和分離度均無顯著影響，流速的增加雖然使得分離度有所降低，但各色譜條件下所有待測(cè)有機(jī)酸的分離度均高于1.7，分離效果良好且無拖尾現(xiàn)象，均可滿足檢測(cè)要求。此外，隨著流速的增加，各有機(jī)酸的保留時(shí)間逐漸減少，末位戊酸峰的出峰時(shí)間由0.5 mL/min流速時(shí)的33.550 min減少至0.7 mL/min流速時(shí)的28.656 min，后者的分離效率更高，分析時(shí)間更少。值得一提的是，流速也對(duì)峰面積有一定的影響，且流速增加會(huì)使柱壓升高，而Hi-Plex配體交換柱是低背壓柱，為了避免壓力過高導(dǎo)致色譜柱損傷，應(yīng)盡量避免通過繼續(xù)增加流速的辦法來提高檢測(cè)效率。綜合考慮分離度、分離效率、流動(dòng)相濃度和柱壓等各方面的因素，本研究確定優(yōu)化后的色譜條件為：流動(dòng)相0.005 mol/L硫酸溶液、流速0.7 mL/min和柱溫60 ℃。

2.2 系統(tǒng)適用性

圖1展示了未經(jīng)偏磷酸預(yù)處理的混標(biāo)液(圖1-A)、經(jīng)偏磷酸預(yù)處理的混標(biāo)液(圖1-B)和瘤胃液樣品(圖1-C)的色譜圖。對(duì)比圖1-A和圖1-B可以看出，未經(jīng)偏磷酸預(yù)處理的混標(biāo)液和經(jīng)偏磷酸預(yù)處理的混標(biāo)液中8種待測(cè)有機(jī)酸的出峰時(shí)間、分離度和峰形均保持一致，相應(yīng)的峰面積在數(shù)值上也均無明顯差異，表明偏磷酸預(yù)處理對(duì)各待測(cè)有機(jī)酸組分無干擾；各相鄰待測(cè)有機(jī)酸色譜峰之間的分離度均大于1.7，滿足分析要求；6次連續(xù)進(jìn)樣間各有機(jī)酸的保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差均低于0.050 min，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，復(fù)現(xiàn)性良好。另外，由待測(cè)瘤胃液樣品的色譜圖(圖1-C)可知，各待測(cè)有機(jī)酸組分的色譜峰與相鄰物質(zhì)色譜峰之間的分離情況良好，足以滿足分析要求。上述結(jié)果表明，所建外標(biāo)定量方法系統(tǒng)適用性良好。

圖1 未經(jīng)偏磷酸預(yù)處理(A)和經(jīng)偏磷酸預(yù)處理(B)的混標(biāo)液A及瘤胃液樣品(C)的色譜圖

2.3 線性、定量限和檢測(cè)限

根據(jù)外標(biāo)法所得各待測(cè)有機(jī)酸的濃度(Y，mmol/L)和峰面積(X)的擬合曲線的線性方程和決定系數(shù)，以及各有機(jī)酸的線性范圍、定量限和檢測(cè)限見表1。由表1可知，乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度的線性范圍分別為0.043 9～7.029 4 mmol/L、0.022 7～9.076 3 mmol/L、0.554 7～88.748 0 mmol/L、0.510 1～81.622 8 mmol/L、0.041 3～6.606 2 mmol/L、0.167 3～26.763 7 mmol/L、0.035 6～5.699 8 mmol/L和0.044 5～7.121 8 mmol/L，且線性范圍下限即為其定量限。同時(shí)，無論是否進(jìn)行偏磷酸預(yù)處理，8種有機(jī)酸線性方程的決定系數(shù)均不低于0.999 9，表明各待測(cè)有機(jī)酸在線性范圍內(nèi)，峰面積和濃度間的線性關(guān)系良好。此外，無論進(jìn)行偏磷酸預(yù)處理與否，同一種有機(jī)酸所得線性方程的斜率和截距在數(shù)量級(jí)上沒有顯著差異，表明是否進(jìn)行偏磷酸預(yù)處理對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線沒有顯著影響。乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度的檢測(cè)限分別為0.015 4、0.007 9、0.194 1、0.178 6、0.005 8、0.058 5、0.012 5和0.017 8 mmol/L，分別相當(dāng)于供試瘤胃液樣品中各目標(biāo)有機(jī)酸濃度的2.399 8%、1.140 8%、0.234 4%、0.624 8%、0.768 6%、0.385 5%、0.618 8%和0.433 1%；另外，各有機(jī)酸濃度的檢測(cè)限約為其定量限的1/3左右，基本符合二者之間稀釋倍數(shù)及信噪比的關(guān)系，表明即使在檢測(cè)限范圍內(nèi)，其線性效應(yīng)可能也是存在的。

表1 各待測(cè)有機(jī)酸的線性參數(shù)、定量限和檢測(cè)限

2.4 目標(biāo)有機(jī)酸的穩(wěn)定性和方法的精密度

由表2可知，混標(biāo)液中各目標(biāo)有機(jī)酸在72 h內(nèi)7次測(cè)定的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值均小于3.30%，保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差均不大于0.056 min，表明8種有機(jī)酸于室溫條件下3 d內(nèi)是穩(wěn)定的，足以滿足分析需要；此外，除了乳酸的RSD值為3.26%外，其余7種有機(jī)酸的RSD值均低于1.00%，表明乳酸的方法穩(wěn)定性略低于其余7種有機(jī)酸。

6份瘤胃液平行樣品中各待測(cè)有機(jī)酸保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差均不大于0.014 min，同時(shí)峰面積的RSD值均小于3.20%，表明本方法的精密度良好。

2.5 方法的準(zhǔn)確度

加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的加標(biāo)回收率范圍分別為82.79%～94.47%、80.56%～102.69%、100.85%～101.57%、104.23%～110.94%、94.23%～97.80%、84.48%～92.37%、95.20%～99.66%和97.45%～111.50%。除少數(shù)低濃度的甲酸和乳酸外，低、中、高3種濃度的加標(biāo)樣液所測(cè)得的各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率均處于90%～110%內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 混標(biāo)液中各目標(biāo)有機(jī)酸的穩(wěn)定性和方法的精密度

表3 瘤胃液中各待測(cè)有機(jī)酸的加標(biāo)回收率

3 討 論

包括乳酸和揮發(fā)性脂肪酸在內(nèi)的多種短鏈有機(jī)酸是動(dòng)物胃腸道中微生物發(fā)酵的重要代謝產(chǎn)物，同時(shí)也對(duì)宿主能量和養(yǎng)分供應(yīng)乃至生理過程均具有重要影響。因此，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確且盡可能多地同時(shí)測(cè)定腸道食糜中各種有機(jī)酸的濃度，對(duì)于研究動(dòng)物腸道營養(yǎng)具有重要意義，尤其是對(duì)于進(jìn)化出專門供微生物棲息和共生的腸室的草食動(dòng)物如牛、羊等反芻家畜而言。本研究建立了一種基于配體交換柱的液相色譜外標(biāo)定量方法，方法使用0.005 mol/L的硫酸溶液為流動(dòng)相，輔以最常用的紫外檢測(cè)器，可同時(shí)檢測(cè)腸道內(nèi)容物中的乳酸和7種VFA濃度。與氣相色譜基礎(chǔ)的方法[11-12,15]相比，本方法不需衍生化處理便可直接測(cè)定甲酸和乳酸，也無需配備載氣或昂貴的質(zhì)譜檢測(cè)器，對(duì)環(huán)境壓力小，且可避免由于二次檢測(cè)導(dǎo)致的工作量的累加；與目前報(bào)道的離子色譜[7]、核磁共振[14]、拉曼光譜[16]和毛細(xì)管電泳法[12]等相比，本方法所需的儀器設(shè)備配置低，且可同時(shí)測(cè)定的有機(jī)酸的種類更多；與目前已報(bào)道的液相色譜法[4,17-18]相比，本方法更為簡(jiǎn)單，分離度更好，且可同時(shí)測(cè)定更多類型的有機(jī)酸，對(duì)腸道內(nèi)容物樣品的適用性更好。

先前的報(bào)道顯示，具有前腸發(fā)酵功能的草食動(dòng)物前胃中VFA的濃度通常在60～150 mmol/L，而具有后腸發(fā)酵能力的動(dòng)物后腸道中VFA的濃度在30～120 mmol/L，且各VFA的組成模式?jīng)]有本質(zhì)上的差異[1]。本研究中所用瘤胃液中目標(biāo)有機(jī)酸的總濃度為137.653 9 mmol/L，其中乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度分別占總量的0.48%、0.52%、61.51%、21.10%、0.56%、11.28%、1.50%和3.05%，其濃度分別為本研究所建方法中各有機(jī)酸的定量限的15、31、149、56、18、91、57和92倍，同時(shí)分別為各有機(jī)酸線性范圍最高濃度的1/11、1/13、1/1.1、1/3、1/9、1/2、1/3和1/2。若按相同的有機(jī)酸組成模式擴(kuò)大或縮小的話，本研究所得各有機(jī)酸的線性范圍完全足以滿足各種類型腸道內(nèi)容物中有機(jī)酸濃度檢測(cè)的需要。值得一提的是，與定量限是由試驗(yàn)測(cè)得而與所用檢測(cè)方法客觀共存的情況不同，本研究中線性范圍上限是根據(jù)前期經(jīng)驗(yàn)所設(shè)，理論上是可以擴(kuò)展的，對(duì)于某些極端狀況如瘤胃酸中毒導(dǎo)致乳酸濃度超過線性范圍上限的情況，讀者可自行增加混標(biāo)液中相應(yīng)酸的濃度以拓展其線性范圍，但需在使用前驗(yàn)證其線性，此外也可對(duì)待測(cè)液進(jìn)行稀釋后再上機(jī)檢測(cè)。

通常認(rèn)為，甲酸和乙酸等短鏈脂肪酸僅在酸性形式下具有揮發(fā)性，而處于陰離子狀態(tài)時(shí)是不具有揮發(fā)性的[1]。然而，本研究中穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，即使在室溫條件下，同一混標(biāo)液中的8種目標(biāo)有機(jī)酸在72 h內(nèi)、7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積RSD值均低于5%的標(biāo)準(zhǔn)，且除乳酸外的其余7種VFA的峰面積RSD值甚至全部低于1%，表明即使是以酸性形式存在的有機(jī)酸，在室溫下也可以相對(duì)穩(wěn)定地保存3 d時(shí)間，足以滿足絕大多數(shù)檢測(cè)的需求，這可能與本方法使用頂空式密閉進(jìn)樣小瓶進(jìn)行保存有關(guān)。需要注意的是，室溫下72 h檢測(cè)時(shí)，乳酸的峰面積在偏磷酸預(yù)處理和未預(yù)處理的混標(biāo)液中分別較0 h增加了9%和4%，而這個(gè)數(shù)值在48 h則僅為4%和2%，因此建議制備好的上機(jī)待測(cè)樣液室溫存放時(shí)間不超過2 d，如有可能在上機(jī)前盡量低溫保存。

動(dòng)物腸道內(nèi)容物作為生物基材料，不可避免地會(huì)含有較多的蛋白質(zhì)、微生物和脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)需要在上機(jī)檢測(cè)前進(jìn)行預(yù)處理加以去除，以免阻塞和損傷色譜柱。根據(jù)前人的研究成果[9,15]和本課題組多年來的經(jīng)驗(yàn)[19]，本研究選用25%偏磷酸溶液以體積比5∶1的比例進(jìn)行預(yù)處理以除去生物大分子物質(zhì)。為了評(píng)價(jià)偏磷酸預(yù)處理是否會(huì)對(duì)目標(biāo)有機(jī)酸的檢測(cè)造成影響，本研究在穩(wěn)定性和線性試驗(yàn)中設(shè)置了空白對(duì)照，并在瘤胃樣液重復(fù)性和回收率試驗(yàn)中直接使用25%偏磷酸溶液進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果表明無論是否進(jìn)行偏磷酸預(yù)處理，各有機(jī)酸的保留時(shí)間、分離度、線性和穩(wěn)定性均無顯著差異，且方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。這些結(jié)果表明使用偏磷酸對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理不會(huì)對(duì)待測(cè)有機(jī)酸的穩(wěn)定性和線性及方法的精密度和準(zhǔn)確度造成負(fù)面影響，這與許麗衛(wèi)等[15]最近的研究結(jié)果相似。

綜上所述，本研究基于配體交換柱建立了一種利用外標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物腸道內(nèi)容物中乳酸和甲酸等8種短鏈有機(jī)酸濃度的液相色譜方法。方法使用25%偏磷酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理后，以0.005 mol/L的硫酸溶液為流動(dòng)相，在0.7 mL/min的流速下使用紫外檢測(cè)器于210 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)。所得各有機(jī)酸的方法檢測(cè)限均不高于所用瘤胃樣液中相應(yīng)酸濃度的2.40%；所得各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的決定系數(shù)均不低于0.999 9，線性關(guān)系良好，且線性范圍足以滿足常見腸道內(nèi)容物中目標(biāo)有機(jī)酸的常規(guī)檢測(cè)需要；混標(biāo)液中各有機(jī)酸組分的峰面積在72 h內(nèi)的RSD值均小于3.30%，穩(wěn)定性良好，但建議上機(jī)待測(cè)樣液的室溫保存時(shí)間不超過48 h。所用瘤胃液樣品的方法重復(fù)性試驗(yàn)中各有機(jī)酸峰面積RSD值均不超過3.20%，回收率試驗(yàn)中各有機(jī)酸絕大多數(shù)的加標(biāo)回收率均處于90%～110%，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了一種同時(shí)檢測(cè)腸道內(nèi)容物中乳酸等8種短鏈有機(jī)酸濃度的液相色譜外標(biāo)定量方法，該方法儀器配置要求低，前處理和流動(dòng)相簡(jiǎn)單，系統(tǒng)適應(yīng)性、線性和穩(wěn)定性良好，方法的精密度和準(zhǔn)確度高，足以滿足腸道內(nèi)容物樣品中目標(biāo)有機(jī)酸的檢測(cè)需要，可為研究營養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物腸道中的消化吸收以及腸道甲烷生成乃至代謝性疾病等方面提供技術(shù)支撐。另外，該法亦可用于其他生物基樣品如沼氣液和青貯發(fā)酵浸提液中短鏈有機(jī)酸的定量分析。