陳履雙 朱樹慶 謝開來 馮霞潔 吳 鑫 孫中華 王麗娜

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣州 510642)

糖類(碳水化合物)是食物中的重要組成部分，也是大多數(shù)生命機體重要的能量來源。一般情況下，人類飲食中碳水化合物含量占比50%以上，而作為畜禽飼料主要原料的玉米中含有碳水化合物在70%以上。此外，在生豬養(yǎng)殖的過程中，還有一些糖類被用作添加劑使用，如在仔豬飼糧中添加低聚木糖可以促生長、改善仔豬的料重比等生長性能[1]。飼糧中添加甘露寡糖可以提高動物的免疫機能和生產(chǎn)性能[2]，可見糖類對于動物機體而言具有至關(guān)重要的作用。半乳糖作為乳汁的主要成分之一，是新生兒的主要營養(yǎng)素，許多研究證明新生兒相對成人來說能更好地利用半乳糖，并且新生兒的半乳糖同化超過葡萄糖[3]。半乳糖已知的應(yīng)用主要包括作為大腦衰老模型的處理物[4]、低能量甜味劑生產(chǎn)的原料[5]以及藥物的前體和載體[6]等。半乳糖進入體內(nèi)后通過鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運體1(sodium/glucose cotransporter 1，SGLT1)活躍地跨膜轉(zhuǎn)運。2個鈉離子首先結(jié)合到轉(zhuǎn)運體的外表面，導(dǎo)致形成變化，允許半乳糖結(jié)合，然后通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(glucose transporter 2，GLUT2)的被動過程通過基底外側(cè)膜轉(zhuǎn)運。半乳糖從腸細胞運輸后，進入門靜脈并運輸?shù)礁闻K，然后在肝臟中被GLUT2內(nèi)化[7]。與葡萄糖和果糖的氧化途徑相比，半乳糖優(yōu)先并入肝糖原，大多數(shù)研究表明，肝臟似乎是半乳糖代謝的最重要器官，然而最近發(fā)現(xiàn)參與半乳糖代謝的酶在其他一些細胞和組織中也有檢測出來[8]。

在畜牧生產(chǎn)中，含有乳糖的干乳清和脫脂奶粉常被添加在飼糧中來緩解斷奶仔豬的應(yīng)激。研究表明，乳糖是一種能顯著影響斷奶仔豬采食量的重要營養(yǎng)物質(zhì)，谷物和植物蛋白質(zhì)型飼糧中添加干乳清和脫脂奶粉等乳制品可以提高仔豬的生長性能。也有研究顯示，飼糧中添加乳糖可以改善仔豬腸道形態(tài)，提高仔豬十二指腸絨毛高度[9]，并且乳糖可以選擇性地刺激嗜酸細菌生長，增加乳酸菌產(chǎn)量，從而調(diào)節(jié)微生物組成，表現(xiàn)出更大的增重和更好的飼料效率[10]；另有研究顯示，海參多糖能夠通過正向調(diào)節(jié)宿主腸道微生物群及其代謝物來緩解糖尿病，包括增加有益細菌的豐度和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)的濃度以及減少病原菌。近年來由于飲料和加工食品中大量的高果糖玉米糖漿的使用，果糖的消耗量顯著增加。近期研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可以消耗果糖轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，減輕了肝臟的負擔以及脂肪肝發(fā)生的幾率[11]。然而，半乳糖是否能夠改善飼糧適口性促進動物生長、調(diào)控動物的腸道健康還未見報道。因此，本研究通過飲水添加和劑量篩選以及后續(xù)的菌群測序和代謝組學檢測來探索半乳糖對于動物生長、腸道菌群和代謝物的影響，為半乳糖在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供新的理論及試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

下丘腦神經(jīng)肽Y(NPY)-綠色熒光蛋白(GFP)/阿片-促黑素細胞皮質(zhì)素原(POMC)-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，初代購自美國Jackson實驗室；3周齡SPF級C57/BL6J小鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。豬腸上皮細胞(IPEC-J2)由吉林大學動物科學學院轉(zhuǎn)贈。半乳糖購自上海生工生物有限公司，純度>98%；乳酸、青霉素、鏈霉素和甲硝唑購自上海生工生物有限公司；異丁酸、2-苯丙酸和氫化肉桂酸購自美國Sigma公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 劑量篩選試驗

選用40只3周齡C57/BL6J公鼠，預(yù)飼維持飼糧1周后按體重隨機分為4組，每組10只。對照組給予飲用雙蒸水，試驗組分別給予半乳糖濃度為0.5%、1.0%和1.5%的飲水，添加劑量由本實驗室前期篩選確定。每3 d更換1次飲水，每周測量其采食量及體重，計算平均日采食量。試驗期4周。

1.2.2 飲水添加1.0%半乳糖對下丘腦神經(jīng)元興奮性的影響

通過劑量篩選試驗，得出飲水中半乳糖的適宜濃度為1.0%。選取6只NPY-GFP小鼠，按體重分為2組，每組3只，以及6只POMC-GFP小鼠，按體重分為2組，每組3只，對照組給予飲用雙蒸水，試驗組給予添加1.0%半乳糖的飲水。每3 d更換1次飲水，1周后使用異氟烷麻醉取全腦，進行免疫熒光試驗，通過計算c-Fos陽性神經(jīng)元與NPY/POMC神經(jīng)元共定位數(shù)量，判定被興奮的神經(jīng)元類型。

1.2.3 偽無菌小鼠模型驗證試驗

選用32只3周齡C57/BL6J公鼠，隨機分為4組，每組8只，對照組給予飲用雙蒸水，半乳糖組給予添加1.0%半乳糖的飲水，半乳糖+抗生素組給予添加1.0%半乳糖+0.3%抗生素(0.1%青霉素、0.1%鏈霉素和0.1%甲硝唑)的飲水，抗生素組給予添加0.3%抗生素(0.1%青霉素、0.1%鏈霉素和0.1%甲硝唑)的飲水，每3 d更換1次飲水，每周測量其采食量和體重，計算平均日采食量。試驗期4周。

1.3 飼養(yǎng)管理

所有小鼠單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每日晝夜各12 h，環(huán)境溫度控制在25 ℃左右，相對濕度控制在60%左右。

1.4 樣品采集

4周后，每組選取3只小鼠進行心臟灌流，以獲取小鼠下丘腦切片樣，其余7只進行眼部采血，后斷頸處死，收集十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的腸道內(nèi)容物、腸道黏膜及腸道組織樣品，液氮冷凍后儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 小鼠體成分檢測

輕微刺激小鼠尾根部使其排盡尿液及糞便，將小鼠置于與儀器配套的圓筒中固定住小鼠，然后將圓筒慢慢推進活體動物體成分檢測儀中進行體組成測定，記錄小鼠肌肉和脂肪的重量及比例。

1.5.2 小鼠整體能量代謝檢測

小鼠單籠飼養(yǎng)于小動物代謝監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)備中，自由飲水及進食，系統(tǒng)溫度濕度及晝夜節(jié)律與鼠房保持一致。小鼠在系統(tǒng)中適應(yīng)24 h后，在隨后的48 h內(nèi)監(jiān)測能量消耗、呼吸熵及自由活動量。

1.5.3 總RNA抽提和實時熒光定量PCR檢測

組織樣品和細胞樣品均使用總RNA抽提試劑盒進行抽提，細胞樣品抽提前每孔取適量無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次，抽提的具體步驟按照試劑盒說明書進行。用核酸濃度測定儀測定抽提出的總RNA的濃度，取1 μg總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA完整性。將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，采用熒光定量PCR方法檢測相關(guān)目的基因相對表達量，取稀釋后的樣品cDNA模版各3 μL，上、下游混合引物1 μL，2×Real-time PCR SYBR Green 10 μL，補水至20 μL。將96孔PCR板置于實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher, 美國)中，按以下程序進行熱循環(huán)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、51～62 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。內(nèi)參基因為β-肌動蛋白，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

續(xù)表1基因 Genes引物序列 Primer sequence (5’—3’)鼠 Mice豬 Sus scrofa白細胞介素-6 F:GCCTTCTTGGGACTGATGCTF:CGGATGCTTCCAATCTGGGTIL-6R:TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGGR:CAGGTGCCCCAGCTACATTA白細胞介素-8 F:CTAGGCATCTTCGTCCGTCF:TGCAGAACTTCGATGCCAGTIL-8R:AGCCCATAGTGGAGTGGGATR:AATTCTTGGGAGCCACGGAG白細胞介素-10 F:GCTCCAAGACCAAGGTGTCTF:TCAAACGAAGGACCAGATIL-10R:AGGACACCATAGCAAAGGGCR:GAAGATGTCAAACTCACCC白細胞介素-13 F:TGCCATCTACAGGACCCAGAF:CTGACCACCAGCATGCAGTAIL-13R:CTCATTAGAAGGGGCCGTGGR:AGACAGCACAGGCTCAAGTC白細胞介素-17 F:GCTGACCCCTAAGAAACCCCF:TCCTGTGAGATCCTCGTCCCIL-17R:GAAGCAGTTTGGGACCCCTTR:ATGATTCCCGCCTTCACGAGβ-肌動蛋白 β-actinF:GGACTTCGAGCAGGAGATGGR:AGGAAGGAGGGCTGGAAGAGF:ACTCACTCTTCTACCTTR:TGTTGCTGTAGCCAAATTCA

1.5.4 蛋白的提取和Western blot檢測

組織總蛋白和細胞總蛋白均采用放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液抽提，組織樣品加入500 μL含有10 mmol/L的蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行勻漿，后轉(zhuǎn)移至離心管并在4 ℃，15 294×g轉(zhuǎn)速下離心15 min；細胞樣品加入100 μL含有2 mmol/L的蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃放置30 min后用移液器刮下細胞，轉(zhuǎn)移至離心管并在4 ℃，15 294×g轉(zhuǎn)速下離心15 min。蛋白濃度用BCA試劑盒測定，具體步驟按照試劑盒使用說明書進行，細胞蛋白分裝變性后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后將膜放在含6%脫脂奶粉中封閉2 h。然后在4 ℃下一抗孵育過夜，第2天用對應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h。使用熒光成像系統(tǒng)測量蛋白質(zhì)表達并標準化。

1.5.5 免疫熒光化學檢測

用異氟烷麻醉小鼠，并用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注，立即收集大腦并在冰冷的4%多聚甲醛中固定過夜，然后將其在30%蔗糖中脫水。在冰凍切片機中將所需腦區(qū)切成約25 μm厚的冠狀腦切片，將切片在PBS中清洗3次，每次10 min。然后，將切片在含5%羊血清的3,3-雙(疊氮甲基)氧雜環(huán)丁烷-四氫呋喃共聚物(PBT)-疊氮化物中封閉2 h。將一抗添加到切片中，然后在室溫下在振蕩器上過夜。第2天，在室溫下避光孵育二抗約1.5 h，封片，之后在免疫熒光顯微鏡下觀察熒光強弱并拍照。隨后在圖像處理軟件Adobe Photoshop中使用計數(shù)工具統(tǒng)計每張腦片中綠色熒光神經(jīng)元數(shù)量，以及與綠色熒光神經(jīng)元共定位的紅色熒光原癌基因蛋白c-Fos(神經(jīng)元興奮標志物)數(shù)量，并計算后者與前者比值作為最后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.5.6 微生物測序和代謝組學檢測

微生物測序和代謝組學及兩者相關(guān)性分析均由上海麥特繪譜生物科技有限公司完成。微生物測序和代謝組學均使用小鼠空腸內(nèi)容物檢測。微生物測序使用Illumina測序平臺，利用雙末端測序(paired-end)的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序，微生物多樣性生物信息分析在Linux平臺上完成。使用宏代謝組學分析質(zhì)譜儀進行代謝組學檢測，統(tǒng)計各類代謝物相對豐度，并采用單維檢驗(依據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性選取t檢驗或Mann-Whitney U檢驗)來獲得2組間的差異代謝物。

1.5.7 腸道炎癥因子含量檢測

腸道中白細胞介素(IL)-4、IL-6和IL-10含量由定制MSD多因子檢測試劑盒進行檢測，試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。

1.5.8 IPEC-J2細胞的復(fù)蘇和處理培養(yǎng)

1)細胞復(fù)蘇：將細胞凍存管從液氮中拿出后迅速放進37 ℃水浴鍋中解凍，溶解后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4 ℃，129×g離心5 min，離心結(jié)束后棄上清，加入完全培養(yǎng)基進行重懸，最后轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

2)處理培養(yǎng)：復(fù)蘇后的細胞經(jīng)過1～2次傳代，待狀態(tài)好的細胞長至90%進行接板，細胞消化重懸后進行細胞計數(shù)，然后以1×104個/cm2的密度接到12孔板中，細胞分為5組，每組6個重復(fù)，待細胞長至60%進行處理，4個組分別添加已篩選出的腸道差異代謝物異丁酸(500 μmol/L)、2-苯丙酸(10 μmol/L)、氫化肉桂酸(10 μmol/L)和乳酸(500 μmol/L)，對照組給予相同體積的PBS，24 h換液，48 h后收板檢測。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Graphpad 7.0統(tǒng)計軟件分析文中柱狀圖所涉及數(shù)據(jù)，統(tǒng)計方法采用t檢驗；采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析文中三線表中所涉及數(shù)據(jù)，半乳糖添加劑量與小鼠體重相關(guān)性采用回歸分析，抗生素與半乳糖共處理試驗數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，多重比較采用最小顯著差異(LSD)法，試驗中所有數(shù)值均采用平均值±標準誤表示，P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和差異極顯著判定標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲水添加半乳糖對小鼠采食量、體重及能量代謝的影響

由圖1可知，與對照組相比，小鼠飲水中分別添加0.5%、1.0%和1.5%半乳糖均能極顯著提高小鼠平均日采食量(P<0.01)，而體重和體組成雖統(tǒng)計學分析無顯著影響(P>0.05)，但從表2的半乳糖添加劑量與小鼠體重回歸分析結(jié)果可以看出，小鼠體重與半乳糖添加劑量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，小鼠體重隨半乳糖添加劑量增加而呈升高趨勢。由于1.0%的半乳糖添加劑量相對于0.5%的添加劑量有更好的促進采食作用，且相對于1.5%的添加劑量效果更穩(wěn)定(圖1-A)，故后續(xù)試驗均以1.0%的添加劑量進行半乳糖處理。

*表示差異顯著(P<0.05), **表示差異極顯著(P<0.01)，無標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖。

表2 半乳糖添加劑量與小鼠體重回歸分析模型

能量代謝方面，與對照組相比，飲水添加半乳糖能極顯著增加小鼠氧氣消耗量(圖2-A和圖2-B)、二氧化碳排放量(圖2-C和圖2-D)和能量消耗水平(圖2-G和圖2-H)(P<0.01)，而對呼吸熵無顯著影響(P>0.05)(圖2-E和圖2-F)。

圖2 飲水添加半乳糖對小鼠整體能量代謝的影響

2.2 飲水添加半乳糖對小鼠下丘腦弓狀核中神經(jīng)元興奮性的影響

為了確定飲水添加半乳糖后下丘腦弓狀核神經(jīng)元興奮性，本試驗選用NPY/POMC-GFP的小鼠進行下丘腦c-Fos染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飲水添加1.0%半乳糖極顯著提高了小鼠NPY神經(jīng)元的興奮性(P<0.01)(圖3-A和圖3-B)，但是對POMC神經(jīng)元的興奮性無顯著影響(P>0.05)(圖3-C和圖3-D)。

NPY:下丘腦神經(jīng)肽Y hypothalamic neuropeptide Y；POMC:阿片-促黑素細胞皮質(zhì)素原 proopiomelanocortin; Merge：合并。A為NPY-GFP小鼠飲水添加1.0%半乳糖后c-Fos與NPY神經(jīng)元共定位情況；B為共定位c-Fos數(shù)量占NPY神經(jīng)元的比例統(tǒng)計圖；C為POMC-GFP小鼠飲水添加1.0%半乳糖后c-Fos與POMC神經(jīng)元共定位情況；D為共定位c-Fos數(shù)量占POMC神經(jīng)元的比例統(tǒng)計圖。A was the co-localization of c-Fos and NPY neurons in NPY-GFP mice after drinking water and adding 1.0% galactose; B was the proportion of co-localized c-Fos in NPY neurons; C was the co-localization of c-Fos and POMC neurons in POMC -GFP mice after drinking water and adding 1.0% galactose; D was the proportion of co-localized c-Fos in POMC neurons.

2.3 飲水添加半乳糖對小鼠腸道糖轉(zhuǎn)運代謝相關(guān)基因表達及炎癥通路的影響

由圖4可知，與對照組相比，飲水添加半乳糖顯著或極顯著降低了小鼠腸道SGLT1(P<0.01)和葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(GLUT1)(P<0.05)的基因相對表達量(圖4-A)，但卻顯著提高了半乳糖激酶(GALK)的基因相對表達量(P<0.05)(圖4-B)，這說明試驗組小鼠轉(zhuǎn)運到肝臟的半乳糖減少，更多的半乳糖在腸道內(nèi)通過Leloir途徑進行代謝。

與此同時，與對照組相比，試驗組小鼠腸道內(nèi)促炎因子IL-1β(P<0.05)、IL-4(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、IL-8(P<0.01)和IL-17(P<0.05)基因相對表達量均顯著或極顯著降低(圖4-C)，并且抗炎因子IL-10和IL-13基因相對表達量也極顯著降低(P<0.01)(圖4-D)，可能由于機體的反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致促炎因子降低后抗炎因子也隨之降低。隨后對腸道中IL-4、IL-6和IL-10的含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組小腸IL-4(P<0.05)、IL-6(P<0.01)和IL-10(P<0.05)的含量均顯著或極顯著降低(圖4-E至圖4-G)，與基因表達結(jié)果趨勢一致。此外，Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，腸上皮細胞炎癥信號通路蛋白蛋白酪氨酸激酶(JAK)、蛋白激酶B(AKT)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)(圖5-A至圖5-F)。

SGLT1：鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運體 sodium/glucose cotransporter 1；GLUT1：葡萄糖轉(zhuǎn)運體1 glucose transporter 1；GLUT2：葡萄糖轉(zhuǎn)運體2 glucose transporter 2；GALK：半乳糖激酶 galactokinase；GALT：半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶 galactose-1-phosphouridine transferase；GALE：尿苷二磷酸4′-變構(gòu)酶 uridine diphosphate 4′-allosteric enzyme；IL：白細胞介素 interleukin。A和B分別為空腸半乳糖轉(zhuǎn)運載體(SGLT1、GLUT1和GLUT2)和半乳糖代謝酶(GALK、GALT和GALE)基因相對表達量；C和D分別為腸道中促炎因子和抗炎因子的基因相對表達量；E、F、G分別為腸道中IL-4、IL-6和IL-10的含量。A and B were the relative expression levels of galactose transporter (SGLT1,GLUT1和GLUT2)and galactose metabolizing enzyme(GALK,GALT和GALE) genes in jejunum, respectively; C and D were the relative expression levels of proinflammatory and anti-inflammatory factors genes in the intestine, respectively; E,F,G were the contents of IL-4, IL-6 and IL-10 in the intestine.

2.4 飲水添加半乳糖對小鼠腸道菌群及代謝物的影響

對小鼠空腸內(nèi)容物進行微生物測序分析，LEfSe分析結(jié)果顯示，半乳糖組中疣微菌門(Verrucomicrobia)和奈瑟菌科(Neisseriaceae)的細菌相對豐度顯著升高(P<0.05)(圖6-A)，包括其中的阿克曼菌屬(Akkermansia)、斯巴桿菌綱(Spartobacteria)、紅桿菌目(Chthoniobacterles)、DA101(不明菌群，屬于疣微菌門)、沙雷氏菌屬(Serratia)、奈瑟菌屬(Neisseria)和腸球菌屬(Enterococccus)，并且降低了羅氏菌屬(Rothia)和月形單胞菌屬(Selenomonas)的相對豐度(圖6-B)。

β-action:β-激動蛋白；JAK：蛋白酪氨酸激酶 protein tyrosine kinase；STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3 signal transducers and activators of transcription 3；JNK：c-Jun氨基末端激酶 C-Jun N-terminal kinase；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 extracellular signal-regulated kinase。

Verrucomicrobiae:疣微菌綱; Verrucomicrobiaceae：疣微菌科；Akkermansia：阿克曼菌屬；Spartobacteria: 斯巴桿菌綱；Chthoniobacterles：紅桿菌目；Chthoniobacteraceae：紅桿菌科；Serratia: 沙雷氏菌屬；Neisseria：奈瑟菌屬；Neisseriales：奈瑟菌目；Neisseriaceae:奈瑟菌科；Enterococccus:腸球菌屬；Rothia：羅氏菌屬；Selenomonas:月形單胞菌屬; Other：其他；s_unclassified: 未分類。A為LEfSe分析差異物種輻射圖(圖中由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別，中心黃色圈代表界，不同分類級別上的每1個小圓圈代表該水平下的1個分類，小圓圈的直徑大小代表了相對豐度的大小)；B為LEfSe分析差異菌群柱狀圖(紅色柱子表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，藍色柱子表示在藍色組別中起到重要作用的微生物類群)。A was the radiation map of different species analyzed by LEfSe (the circle radiated from inside to outside represents the classification level from phylum to genus, the central yellow circle represents the boundary, each small circle on different classification levels represents a classification under this level, and the diameter of the small circle represents the size of relative abundance); B was the histogram of different flora in LEfSe analysis (the red column indicates the microbial groups that play an important role in control group, and the blue column indicates the microbial groups that play an important role in galactose group).

隨后代謝組學檢測發(fā)現(xiàn)，半乳糖組中有機酸和短鏈脂肪酸(SCFAs)2類代謝物相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)(圖7-A)，其中包括異丁酸、乳酸、2-苯丙酸、氫化肉桂酸、酮亮氨酸、乙醇酸、核酮糖和甘油酸，并且己二酸和牛磺鼠膽酸(TaMCA/TbMCA)的相對豐度顯著降低(P<0.05)(圖7-B)。

Carbohydrates：碳水化合物；Amino acids：氨基酸；Bile acids：膽汁酸；Fatty acids：膽汁酸；Organic acids：有機酸；SCFAs:短鏈脂肪酸；Benzenoids:苯型烴類;Pyridines:吡啶類;Phenylpropionic acids：苯丙酸；Carnitines:肉堿；Benzoic acids:苯甲酸；Phenols:酚類；Imidazoles:咪唑；Indoles:吲哚；Isobutyric acids：異丁酸；Lactic acids：乳酸；2-phenylpropionate：2-苯丙酸；Hydrocinnamic acid：氫化肉桂酸/3-苯丙酸；Ketoleucine：酮亮氨酸；Glycolic acid：乙醇酸；Glyceric acid：甘油酸；Adipic acid：己二酸；Ribulose：核酮糖; TaMCA/TbMCA：己二酸/牛黃鼠膽酸 adipic acid /taurine cholic acid。圖7同 the same as Fig.7。A為各代謝物類別的相對豐度；B為差異代謝物單維代謝火山圖(圖中右上角紅色表示代謝物相對豐度在半乳糖組中升高，左上角藍色表示代謝物在半乳糖組中降低)。A was the relative abundance of each metabolite category; B was the one-dimensional metabolic volcano map of differential metabolites (the red dot in the upper right corner indicated that the metabolites were increased in the galactose group, and blue dot in the upper left corner indicates that the metabolites were decreased in the galactose group).

對腸道微生物測序結(jié)果與代謝組中各差異代謝物進行相關(guān)性分析可以發(fā)現(xiàn)，半乳糖組中升高的酸類代謝物含量均與可以發(fā)酵糖類產(chǎn)酸的沙雷氏菌相對豐度呈顯著正相關(guān)，而苯類代謝物含量均與聯(lián)苯降解菌DA101相對豐度呈顯著正相關(guān)(圖8-A和圖8-B)。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，小鼠飲水添加半乳糖顯著或極顯著提高了腸道中脂肪酸受體GPR41(P<0.01)和GPR43(P<0.05)的基因相對表達量(圖9-A和圖9-B)。

2.5 半乳糖差異代謝物對IPEC-J2細胞炎癥信號的影響

為了探究半乳糖是否通過其代謝物異丁酸(IBA)、乳酸(LA)、2-苯丙酸(2-PA)和氫化肉桂酸(HA)等發(fā)揮作用，使用IPEC-J2細胞作為試驗對象，檢測上述代謝物對細胞炎癥因子的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，幾種代謝物均能調(diào)控細胞的炎癥狀態(tài)，與對照組相比，其中異丁酸顯著或極顯著降低了細胞中IL-6(P<0.05)和IL-8(P<0.01)的基因相對表達量(圖10-A)，而另外3種處理物則同時顯著或極顯著升高了細胞中促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的基因相對表達量(P<0.05或P<0.01)(圖10-B、圖10-C和圖10-D)。由定量結(jié)果可知，半乳糖代謝物中異丁酸具有較強的抑制炎癥作用，隨后對異丁酸處理的細胞同樣檢測上述幾種蛋白表達，結(jié)果顯示，異丁酸處理后細胞中JAK和AKT蛋白表達水平同樣顯著降低(P<0.05)(圖10-H和圖10-I)。

2.6 抗生素處理可消除半乳糖的促進采食作用

依據(jù)以上結(jié)果，猜測半乳糖可能是通過調(diào)控腸道菌群相對豐度及代謝物含量來發(fā)揮促進采食的作用，所以，本試驗對小鼠進行抗生素添加來清除小鼠的腸道微生物，由表3可知，失去腸道微生物后半乳糖促進采食的作用被消除，初步驗證了本試驗的猜想。

A為腸道菌群和差異代謝物相對豐度的相關(guān)性分析熱圖(暖色表示正相關(guān)，冷色表示負相關(guān))；B為相關(guān)性顯著的菌群和代謝物的網(wǎng)狀圖。A was the heat map of correlation analysis between intestinal flora and metabolites (warm color indicates positive correlation and cold color indicates negative correlation); B was the network diagram of bacterial flora and metabolites with significant correlation.

GPR41：G蛋白偶聯(lián)受體41 G protein coupled receptor 41；GPR43：G蛋白偶聯(lián)受體43 G protein coupled receptor 43。

3 討 論

乳糖在生產(chǎn)中常用于過渡仔豬斷奶應(yīng)激，促進仔豬采食量并改善腸道健康[12]，而半乳糖作為乳糖的組成單糖之一，可能與乳糖有相似地改善腸道健康的功效。本研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加0.5%、1.0%和1.5%的半乳糖均會顯著提高小鼠的平均日采食量，其中1.0%的添加劑量效果較好，并且小鼠體重與半乳糖添加劑量呈顯著正相關(guān)，隨著半乳糖添加劑量增加小鼠體重有上升趨勢。糖類對于動物采食行為的影響已有較多報導(dǎo)，蔗糖由于其發(fā)現(xiàn)早、易提取以及甜度高的特性在生產(chǎn)、生活中使用率較高。在成年男性的一項研究中表明，蔗糖會在短期內(nèi)抑制食欲[13]，另一項研究也表明，飲用蔗糖后其他能量攝入會減少，但是包括蔗糖在內(nèi)的總能量攝入量沒有變化[14]。除蔗糖外，葡萄糖在機體中的作用更為重要，研究表明，餐前進食葡萄糖會抑制食物攝入量，飽腹感是食物攝入減少的關(guān)鍵，進食蔗糖或葡萄糖后腦內(nèi)葡萄糖水平升高，所以飽腹感升高抑制采食量[15]。在大腦中，丙二酰輔酶A具有監(jiān)測和調(diào)節(jié)能量平衡的重要功能，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖處理會導(dǎo)致下丘腦ATP水平升高，同時單磷酸腺苷(AMP)水平降低，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)失活，丙二酰輔酶A活性增加，從而抑制食物攝入[16]。但另一研究表明，在小鼠大腦室旁核中注射葡萄糖會促進禁食18 h小鼠的采食量，并且這種作用可能是通過血漿瘦素和生長素釋放肽水平的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制介導(dǎo)的[17]。與蔗糖、果糖等高甜度高熱量糖類相比，半乳糖低熱量的特點使其進入胃腸道后不易引起飽腹感。而半乳糖和葡萄糖同為組成乳糖的單糖之一，對于動物生長和采食量的影響及作用途徑也大不相同，從本研究的結(jié)果來看，相比于葡萄糖，乳糖的功效或許更依賴于半乳糖，這也提示半乳糖可能在腸道健康中發(fā)揮重要作用。

IBA：異丁酸 isobutyric acid；LA：乳酸 lactic acid；2-PA：2-苯丙酸 2 - phenyl propionic acid；HA：氫化肉桂酸 hydrocinnamic acid；JAK：蛋白酪氨酸激酶 protein tyrosine kinase；STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3 signal transducers and activators of transcription 3；JNK：c-Jun氨基末端激酶 C-Jun N-terminal kinase；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 extracellular signal-regulated kinase; β-action:β-激動蛋白。A～D分別為IBA、LA、2-PA和HA對腸道炎癥因子基因相對表達量的影響；E～J分別為IBA對細胞中JAK、STAT3、PI3K、AKT、JNK和ERK蛋白表達的影響。

表3 抗生素處理可消除半乳糖的促采食作用

本研究中16s rDNA高通量測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飲水中的半乳糖增加了小鼠腸道中阿克曼菌屬、斯巴桿菌綱和紅桿菌目等細菌的相對豐度。腸道菌群在宿主的健康、抵御病原體、代謝飲食中的營養(yǎng)物質(zhì)和藥物、影響飲食中脂肪的吸收和分布等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]，并且由于其組成的整體平衡性，微生物群落不僅在胃腸道范圍內(nèi)發(fā)揮作用，甚至可以通過腦-腸軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19]。作為近年來的一個研究熱點，越來越多研究表明，阿克曼菌屬具有預(yù)防和治療肥胖癥、2型糖尿病和其他代謝功能障礙的作用[20-21]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，阿克曼菌屬相對豐度與小鼠和人類的體重成反比[22]，這也與本試驗結(jié)果相符，并且可通過誘導(dǎo)叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)調(diào)節(jié)T細胞顯著提高肥胖小鼠的葡萄糖耐量并減輕脂肪炎癥[23-24]，證明了半乳糖有改善腸道菌群組成的作用。

在此基礎(chǔ)上，代謝組學的研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加半乳糖之后，異丁酸等短鏈脂肪酸的含量增加，并且腸道中短鏈脂肪酸受體的基因表達水平顯著升高，另外半乳糖處理顯著降低了腸道中白細胞介素家族的部分炎癥因子的基因表達，包括促炎因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和IL-17以及抗炎因子IL-10和IL-13。異丁酸屬于一種短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸的形成是飲食和腸道微生物群之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果，并且主要通過碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)生。越來越多研究證明了短鏈脂肪酸在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，研究表明，短鏈脂肪酸是維持結(jié)腸上皮的重要底物，尤其是丁酸鹽，并且丁酸鹽已被證明可逆轉(zhuǎn)緊密連接蛋白-1(ZO-1)的異常表達并減少脂多糖(LPS)易位，從而抑制巨噬細胞活化、促炎細胞因子產(chǎn)生和中性粒細胞浸潤，從而減輕大鼠的肝臟損傷[25]。已有眾多研究證實，短鏈脂肪酸通過不同機制上調(diào)抗炎和下調(diào)促炎細胞因子，從而促進黏膜穩(wěn)態(tài)，從而具有全面的抗炎作用[26]。也有研究表明，短鏈脂肪酸受體GPR41和GPR43在炎癥反應(yīng)中起重要作用，丙酸鹽可以通過GPR41抑制IL-4、IL-5和IL-17A的表達[27]，丁酸鹽可以抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和單核細胞趨化蛋白1的表達[28]。隨后的炎癥相關(guān)信號通路研究結(jié)果顯示，在體試驗中半乳糖處理顯著降低了小鼠腸道JAK、AKT和ERK蛋白的磷酸化水平，異丁酸處理的細胞中JAK和AKT蛋白磷酸化水平也顯著降低，說明JAK和AKT在半乳糖降低炎癥的過程中可能發(fā)揮重要作用。大量研究表明，高糖尤其是果糖和蔗糖等高熱量的飲食以及高脂和低膳食纖維的飲食習慣均會引起肥胖和代謝綜合征[29-30]，而這也是引起腸道炎癥、結(jié)腸癌和炎癥性腸病的重要因素[31-32]。但本研究中半乳糖不但不會引起機體肥胖和腸道炎癥，反而可以降低腸道炎癥，改善腸道健康，這可能是半乳糖作為一種低熱量糖特有的功效。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)飲水中添加0.5%、1.0%和1.5%的半乳糖均可提高小鼠的平均日采食量，其中1.0%的添加劑量效果較好，并且小鼠體重有隨半乳糖添加劑量增加而上升的趨勢；半乳糖可以改善小鼠腸道菌群組成，并在腸道菌群作用下發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸道炎癥，改善腸道健康。