詹 康 譚德金 孟梓橦 馬曉宇 趙國琦

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

奶牛生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)奶量，一般會在飼糧中添加高精料，但長時間飼喂高精料會誘發(fā)奶牛亞急性酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)和一些營養(yǎng)代謝性疾病，如瘤胃炎、蹄葉炎、間歇性腹瀉等，并導致產(chǎn)奶量下降[1-3]，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。其原因主要是飼喂高精料產(chǎn)生大量的有機酸，導致瘤胃pH急劇下降和微生物解體并釋放大量脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、組胺和細菌抗原肽物質，引起奶牛系統(tǒng)性炎癥反應[4]。目前，SARA主要有3種學說，包括短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)、乳酸和內(nèi)毒素中毒學說，其中比較接受的是SCFAs中毒學說[5]。

SCFAs是瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵飼糧中碳水化合物產(chǎn)生的含有2～6個碳原子的脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占總揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)的95%[6]。SCFAs能夠被瘤胃上皮組織通過簡單擴散或相關的SCFAs轉運蛋白吸收進入血液[7-8]。之前的研究表明，SCFAs能調(diào)節(jié)瘤胃上皮的炎癥反應[9]。研究顯示，濃度為5～40 mmol/L的SCFAs能夠促進奶牛瘤胃上皮細胞(bovine rumen epithelial cells，BRECs)中促炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達以及趨化因子CC趨化因子20(CCL20)、CXC趨化因子2(CXCL2)、CXC趨化因子3(CXCL3)和CXC趨化因子8(CXCL8)的表達[10]。然而，目前并未見在SARA條件下SCFAs濃度對BRECs炎癥反應和瘤胃上皮屏障影響的研究。泌乳中期奶牛飼喂正常飼糧時，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度在80 mmol/L左右。SARA條件下，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度一般在100 mmol/L[11]。奶牛在SARA條件下能引起瘤胃上皮炎癥反應和破壞瘤胃上皮的屏障功能。因此，我們假設高濃度的SCFAs能促進瘤胃上皮的促炎癥反應和破壞瘤胃上皮屏障功能。

SCFAs刺激乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)能夠顯著加強p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的激活，而添加200 ng/mL的百日咳毒素與BMECs孵育之后，結合和抑制了細胞的Gi/o家族蛋白，這個結果暗示SCFAs刺激BMECs的炎癥反應受到了Gi/o家族蛋白的調(diào)控[12]。之前的研究已經(jīng)報道，G-蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41，GPR41)介導SCFAs調(diào)控BRECs炎癥反應[9]。SCFAs通過激活小鼠結腸上皮細胞的GPR41和G-蛋白偶聯(lián)受體43(G protein-coupled receptor 43，GPR43)來積極響應免疫應答并激活p38和磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(pERK1/2)MAPK信號通路，從而介導保護性免疫反應[13]。隨著SCFAs濃度(5～40 mmol/L)逐漸升高，GPR41表達量也逐漸增加[10]，然而，SARA條件下SCFAs濃度對GPR41表達的影響仍未知。之前的研究中，GPR41和GPR43作為SCFAs的受體已經(jīng)被證明[14]，并且GPR41已經(jīng)被證明能夠在BRECs中表達[15]，但未檢測到GPR43在BRECs表達[9]。SARA條件下產(chǎn)生高濃度的SCFAs對BRECs免疫反應、緊密連接蛋白和GPR41表達的相關研究還未見報道。因此，本試驗目的是研究不同濃度SCFAs對BRECs免疫反應、緊密連接蛋白和GPR41表達的影響，旨在理解GPR41在BRECs炎癥反應調(diào)控中的作用，這可為理解瘤胃上皮炎癥反應的潛在機制帶來新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品；乙酸、丙酸、丁酸、青霉素、鏈霉素和乙二胺四乙酸(EDTA)為美國Sigma公司產(chǎn)品；熒光定量96孔板和8連管為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 BRECs培養(yǎng)

BRECs來自于揚州大學動物培養(yǎng)物保存與應用研究所(Institute of Animal Culture Collection and Application，YangzhouUniversity，IACCA)。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BRECs，待細胞密度達到培養(yǎng)瓶70%生長面積，用0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化細胞，放置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱溫育3 min，培養(yǎng)瓶中的細胞開始發(fā)亮并從瓶底脫落，拍打培養(yǎng)瓶數(shù)次。如果還有部分BRECs未從培養(yǎng)瓶底部脫落，再放置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱溫育2 min，用力拍打培養(yǎng)瓶數(shù)次，直至細胞全部脫落。用5 mL含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，傳至3個25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞密度再次達到培養(yǎng)瓶80%生長面積，這一過程需要3 d。

1.2.2 試驗設計

試驗設4個試驗組，在培養(yǎng)基中分別添加20、50、100和150 mmol/L SCFAs培養(yǎng)BRECs 24 h。培養(yǎng)24 h之后，細胞被收集提取總RNA。每組設3個重復。20 mmol/L SCFAs由12 mmol/L乙酸、5 mmol/L丙酸和3 mmol/L丁酸組成。50 mmol/L SCFAs由30 mmol/L乙酸、12.5 mmol/L丙酸和7.5 mmol/L丁酸組成。100 mmol/L SCFAs由60 mmol/L乙酸、25 mmol/L丙酸和15 mmol/L丁酸組成。150 mmol/L SCFAs由90 mmol/L乙酸、37.5 mmol/L丙酸和 22.5 mmol/L丁酸組成。

1.2.3 反轉錄cDNA

按照TaKaRa反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，試驗于冰上操作，反轉錄體系由500 ng總RNA、2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix和無RNA酶水組成，總體積為10 μL。反應條件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s。

1.2.4 熒光定量PCR

PCR反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10 μL、上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板100 ng和滅菌蒸餾水，總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品3個重復且使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，隨后在凝膠成像儀中觀察PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR引物在表1中列出。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)結果用“平均值±標準差”表示。運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)模塊進行單因素方差分析，顯著性檢驗應用LSD法進行。P<0.10表示為差異有顯著趨勢，P<0.05表示差異顯著。相關性使用GraphPad Prism 6軟件進行分析。相關系數(shù)用r表示，r>0為正相關，r<0為負相關；|r|越接近1，相關性越強，|r|越接近0，相關性越弱。

2 結果與分析

2.1 不同濃度SCFAs對促炎癥因子表達的影響

由圖1可知，與添加20和50 mmol/L SCFAs時相比，添加100和150 mmol/L SCFAs時促炎癥因子IL-1β的mRNA相對表達量并未發(fā)現(xiàn)顯著改變(P>0.05)，但TNF-α的mRNA相對表達量被顯著提高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Data columns with different letters mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 不同濃度SCFAs對趨化因子基因表達的影響

由圖2-A和圖2-B可知，與添加20和50 mmol/L SCFAs時相比，添加100 mmol/L SCFAs時CCL20和CXCL2的mRNA相對表達量被顯著上調(diào)(P<0.05)，然而，添加150 mmol/L SCFAs時CCL20和CXCL2的mRNA相對表達量與添加100 mmol/L SCFAs時相比被顯著下調(diào)(P<0.05)。由圖2-C、圖2-D和圖2-E可知，隨著SCFAs濃度的增加，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達量逐漸下調(diào)；更為重要的是，添加150 mmol/L SCFAs時，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達量最低。

圖2 不同濃度SCFAs對趨化因子表達的影響

2.3 不同濃度SCFAs對GPR41和緊密連接蛋白表達的影響

由圖3-A可知，隨著SCFAs濃度從20 mmol/L上升至100 mmol/L，GPR41的mRNA相對表達量被逐漸上調(diào)。SCFAs濃度為100 mmol/L時，GPR41的mRNA相對表達量顯著高于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時(P<0.05)；然而，SCFAs濃度為150 mmol/L時，GPR41的mRNA相對表達量與SCFAs濃度為100 mmol/L時相比并沒有發(fā)生顯著改變(P>0.05)。SCFAs濃度為150 mmol/L時，緊密連接蛋白閉合蛋白-1(Claudin-1)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的mRNA相對表達量最低(圖3-C和圖3-D)，且顯著低于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時(P<0.05)。

圖3 不同濃度SCFAs對GPR41和緊密連接蛋白表達的影響

2.4 BRECs中GPR41與免疫細胞因子的關聯(lián)分析

由圖4可知，GPR41的mRNA相對表達量與促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達量呈顯著正相關(P<0.05)。然而，GPR41的mRNA相對表達量與趨化因子CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達量呈顯著負相關(P<0.05)。

圖4 BRECs中GPR41 mRNA相對表達量與免疫細胞因子mRNA相對表達量之間的相關性

2.5 BRECs中GPR41與緊密連接蛋白的關聯(lián)分析

由圖5可知，GPR41的mRNA相對表達量與緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達量呈負相關趨勢(0.05≤P<0.10)。

圖5 BRECs中GPR41 mRNA相對表達量與緊密連接蛋白mRNA相對表達量之間的相關性

3 討 論

長期飼喂高精料飼糧會誘發(fā)奶牛SARA營養(yǎng)代謝病，導致瘤胃內(nèi)有機酸大量累積和瘤胃pH急劇下降，瘤胃含大量H+，從而改變瘤胃內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，打破瘤胃菌群結構平衡，影響瘤胃微生物區(qū)系多樣性并誘發(fā)微生物解體釋放大量細菌抗原肽和LPS等促炎癥因子，破壞瘤胃上皮的免疫屏障功能，引起奶牛瘤胃上皮炎癥反應以及機體的系統(tǒng)性炎癥反應[16]。奶牛SARA條件下，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的有機酸大部分是SCFAs，因此，SCFAs是誘發(fā)奶牛瘤胃上皮促炎癥反應的重要因素。SARA條件下，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度一般在100 mmol/L，有時甚至更高[11]。本試驗結果證明，100和150 mmol/L的SCFAs能誘導BRECs的促炎癥反應，抑制趨化因子表達和瘤胃宿主的免疫應答，減少緊密連接蛋白的表達，破壞瘤胃上皮的屏障功能。

在現(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)奶量，通常使用高精料飼糧，然而長時間飼喂高精料會誘發(fā)瘤胃SARA。目前，SARA主要有3種學說，包括SCFAs、乳酸和內(nèi)毒素中毒學說。目前研究較多的是SCFAs中毒學說。研究顯示，長時間飼喂高精料產(chǎn)生大量有機酸，誘發(fā)瘤胃上皮促炎癥反應，增加瘤胃上皮的通透性[17]。此外，SARA條件下產(chǎn)生更多的SCFAs，激活MAPK和核因子-κB(NF-κB)信號通路，進而促進瘤胃上皮促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達[11]。隨著SCFAs濃度的增加，能夠激活BRECs中促炎癥因子TNF-α表達，尤其是SCFAs濃度達到150 mmol/L時，BRECs中促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達量最高。上述結果表明，高濃度SCFAs能誘導瘤胃上皮的促炎癥反應。之前的研究也顯示，低濃度的SCFAs顯著上調(diào)大部分CCL型和CXCL型趨化因子的表達，加強瘤胃上皮免疫應答反應[9]。趨化因子的主要作用是趨化免疫細胞如巨噬細胞和中性粒細胞到達組織受感染的部位進行免疫應答和促進殺傷細胞進行加工和處理抗原[18]。值得注意的是，添加150 mmol/L SCFAs孵育BRECs時，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達量最低，這表明高濃度SCFAs減少BRECs中趨化因子的表達，抑制瘤胃上皮的免疫應答。因為趨化因子表達量的增加能夠進一步促進免疫細胞趨化至瘤胃免疫層來加工處理抗原肽。

奶牛瘤胃上皮含有許多屏障層特性，包括角質層、顆粒層、棘層和基底層，這4層相互作用和交叉聯(lián)系，在宿主和瘤胃微生物之間建立屏障保護，維持瘤胃穩(wěn)態(tài)。緊密連接蛋白位于瘤胃上皮的中間層，對于瘤胃上皮細胞的分化、調(diào)控上皮屏障的間隙和阻止內(nèi)毒素移位至血液至關重要[19-20]。緊密連接蛋白主要由閉合蛋白(Claudins)、Occludin和ZO-1組成，它們與細胞骨架的穩(wěn)定性密切相關[21]。高精料飼糧飼喂條件下抑制Claudins、Occludin和ZO-1的表達，并引起瘤胃上皮促炎癥因子TNF-α的表達，因此，瘤胃上皮緊密連接蛋白的穩(wěn)定與瘤胃上皮免疫屏障對奶牛健康具有至關重要的作用[22]。本試驗結果顯示，SCFAs濃度為150 mmol/L時，緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達量顯著低于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時且此時表達量最低，結果證明，高濃度的SCFAs能破壞BRECs的免疫屏障功能。SCFAs濃度由20 mmol/L增加至100 mmol/L，BRECs中GPR41的表達被激活。但是，SCFAs濃度由100 mmol/L增加至150 mmol/L時，BRECs中GPR41的mRNA相對表達量并沒有被改變。此外，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，GPR41的mRNA相對表達量與促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達量呈顯著正相關；然而，GPR41的mRNA相對表達量與趨化因子CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達量呈顯著負相關；同時，GPR41的mRNA相對表達量與緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達量呈負相關趨勢。以上結果表明，SCFAs通過GPR41負調(diào)控BRECs的中趨化因子和緊密連接蛋白的表達。

4 結 論

100和150 mmol/L的SCFAs能誘導BRECs的促炎癥反應，抑制趨化因子表達和免疫反應，減少緊密連接蛋白的表達，破壞瘤胃上皮的免疫屏障功能。