李宜芳 陳 團(tuán) 胡 毅 石 勇 鐘 蕾
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410128)
蛋白質(zhì)是魚(yú)類(lèi)必需的營(yíng)養(yǎng)素,也是水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、組織修復(fù)及維持機(jī)體健康等生命活動(dòng)的主要載體[1]。水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料蛋白質(zhì)水平要求高,水產(chǎn)動(dòng)物飼料配方中蛋白質(zhì)源飼料占比超過(guò)70%。如何降低飼料蛋白質(zhì)水平而不影響水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)是行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn),提高飼料中蛋白質(zhì)的利用率有助于緩解低蛋白質(zhì)飼料引起的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能和免疫功能下降現(xiàn)象[2]。大量研究表明,功能性植物提取物對(duì)提高飼料蛋白質(zhì)利用率和魚(yú)類(lèi)免疫力切實(shí)可行,已有海帶多糖(laminarin)增強(qiáng)斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)免疫功能[3]、穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)提高露斯塔野鯪(Labeorohita)的非特異性免疫能力[4]、黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide)提高斑馬魚(yú)(Brachydanioreriovar)生長(zhǎng)性能[5]以及巖藻多糖(fucoidan)提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能及抗氧化能力[6]等相關(guān)研究。
血根堿(sanguinarine)是一種苯菲啶異喹啉類(lèi)生物堿,是國(guó)內(nèi)首個(gè)天然植物源性藥物飼料添加劑,不僅具有抗炎[7]、抗菌[8]和抗氧化[9]等作用,還可提高動(dòng)物對(duì)飼料蛋白質(zhì)的利用率[10],促進(jìn)機(jī)體對(duì)氨基酸的吸收[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明,黃鱔(Monopterusalbus)飼料中添加750 μg/kg血根堿,可以緩解由大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對(duì)魚(yú)體造成的免疫應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[7];高棉籽粕-菜籽粕中添加血根堿可促進(jìn)草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)生長(zhǎng),改善腸道組織形態(tài)及微生物群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)腸道免疫屏障功能。此外,在銀大眼鯧(Monodactylusargenteus)[12]、金魚(yú)(Carassiusauratus)[13]、錦鯉(Cryprinuscarpiod)[14]等研究中已證明,血根堿可提高魚(yú)體生長(zhǎng)性能及免疫應(yīng)答,緩解炎癥反應(yīng),改善腸道微生物群落結(jié)構(gòu),具有良好的應(yīng)用前景。然而,血根堿在低蛋白質(zhì)飼料中的應(yīng)用研究還未見(jiàn)報(bào)道。
草魚(yú)隸屬于鯉科、草魚(yú)屬,是典型的草食性魚(yú)類(lèi)[15]?!?021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示,草魚(yú)產(chǎn)量為557.11萬(wàn)t,穩(wěn)居淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)第一[16]。草魚(yú)魚(yú)苗到魚(yú)種階段蛋白質(zhì)需求量為30%~35%[17]。蛋白質(zhì)是飼料的主要部分,在養(yǎng)殖成本中,飼料成本占比達(dá)50%以上。因此,本研究以草魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象,研究低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和腸道健康的調(diào)節(jié)作用,為有效降低養(yǎng)殖成本及血根堿在魚(yú)類(lèi)飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
參照草魚(yú)商品飼料配方,設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30.00%的飼料為正常蛋白質(zhì)組(CON組);降低正常蛋白質(zhì)組飼料中魚(yú)粉和豆粕水平,以蛋白質(zhì)水平為28.00%的飼料為低蛋白質(zhì)組,并在低蛋白質(zhì)飼料中分別添加0(Sa0組)、200(Sa200組)、400(Sa400組)和800 mg/kg(Sa800組)的血根堿(血根堿由湖南某生物資源有限公司提供,純度為0.15%,實(shí)際加入的血根堿為0、0.3、0.6和1.2 mg/kg),共配制5組飼料。飼料原料經(jīng)利達(dá)超微粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩,按照配方要求準(zhǔn)確稱(chēng)量各種原料,混勻后采用雙螺旋壓條機(jī)擠壓出粒徑2.0 mm的顆粒飼料,于陰涼處風(fēng)干后,-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsCONSa0Sa200Sa400Sa800粗脂肪 Crude fat56.959.359.359.359.3粗灰分 Ash92.686.386.386.386.3水分 Moisture102.0126.4126.4126.4126.4
飼養(yǎng)試驗(yàn)于湖南省婁底市車(chē)田江水庫(kù)網(wǎng)箱中進(jìn)行,試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)回后,暫養(yǎng)于5 m×4 m×3 m的網(wǎng)箱中,待其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后,隨機(jī)挑選體格健壯、規(guī)格統(tǒng)一的草魚(yú)375尾,初始體重為(91.04±0.37) g,置于2 m×2 m×2 m的網(wǎng)箱中,試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)25尾魚(yú),試驗(yàn)持續(xù)8周。使用30.00%正常蛋白質(zhì)水平飼料對(duì)試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行1周左右馴化,待其可以正常攝食后,正式開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)期間,日投喂量以草魚(yú)體重的3%~5%為標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)天氣及攝食情況進(jìn)行調(diào)整。記錄每日水溫、天氣、攝食及死亡情況。試驗(yàn)期間水體氨氮濃度≤0.20 mg/L,水溫為(27.3±3.6) ℃。
1.3.1 草魚(yú)生長(zhǎng)性能測(cè)定
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí),停食24 h,記錄每個(gè)網(wǎng)箱試驗(yàn)魚(yú)的總尾數(shù)和總體重以及投喂飼料量等,計(jì)算草魚(yú)增重率(weight gain rate,WGR)、成活率(survival rate,SR)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)和攝食率(feed rate,FR)等生長(zhǎng)性能指標(biāo)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾魚(yú),測(cè)定體長(zhǎng)、體重、內(nèi)臟團(tuán)及肝臟質(zhì)量,計(jì)算肥滿度(condition factor,CF)、肝體比(hepatosomatic index,HSI)和臟體比(viscerosomatic index,VSI)。
增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0;
成活率(%)=100×(Nt/N0);
飼料系數(shù)=Wf/(Wt-W0);
蛋白質(zhì)效率(%)=100×[(Wt-W0)/Fp];
攝食率(%/d)=100×Wf/[(W1+W2)×d/2];
肥滿度(g/cm3)=100×W/L3;
肝體比(%)=100×Wh/W;
臟體比(%)=100×Wv/W。
式中:Wt為終末總體重(g);W0為初始總體重(g);Nt為終末尾數(shù);N0為初始尾數(shù);Wf為攝入飼料量;W1為初始均重;W2為終末均重;d為養(yǎng)殖天數(shù);Fp為蛋白質(zhì)攝入量;Wh為魚(yú)肝臟重(g);Wv為魚(yú)內(nèi)臟重(g);L為采樣個(gè)體體長(zhǎng)(cm);W為采樣個(gè)體體重(g)。
1.3.2 草魚(yú)血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性及抗氧化能力的測(cè)定
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,停食24 h,每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾魚(yú),用1.0 mL無(wú)菌注射器尾靜脈取血,置于1.5 mL離心管中,4 ℃靜置過(guò)夜,3 000 r/min離心10 min,取上清液混裝于0.5 mL無(wú)菌離心管中,-80 ℃保存。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾草魚(yú),迅速分離腸道組織,用生理鹽水清洗,裝于1.5 mL的無(wú)酶離心管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
草魚(yú)血清葡萄糖(glucose,GLU)、總蛋白(total protein,TP)、總膽固醇(total cholesterol,TCHO)、甘油三酯(triglyceride,TG)、尿素氮(urea nitrogen,UN)含量,腸道胰蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及丙二醛(malondiadehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量等指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。
1.3.3 草魚(yú)腸道組織切片的制作與觀察
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,停食24 h,每個(gè)網(wǎng)箱取3尾草魚(yú),解剖分離無(wú)內(nèi)容物的后腸,用4%甲醛溶液固定24 h,采用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示。
由表2可知,各組草魚(yú)終末體重、增重率、飼料系數(shù)、成活率、蛋白質(zhì)效率、攝食率、肝體比和臟體比之間均無(wú)顯著差異(P>0.05);與Sa0組相比,Sa800組草魚(yú)肥滿度顯著降低(P<0.05),其他各組草魚(yú)肥滿度之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表2 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響
由表3可知,與CON組相比,Sa0組、Sa200組和Sa400組草魚(yú)血清葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量有所降低(P>0.05),且3組間上述指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05);Sa800組血清葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量有所提高(P>0.05)。此外,Sa800組草魚(yú)血清葡萄糖和甘油三酯含量顯著高于Sa0組、Sa200組和Sa400組(P<0.05),血清總膽固醇含量顯著高于Sa400組(P<0.05)。各組草魚(yú)血清總蛋白和尿素氮含量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表3 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對(duì)草魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響
由表4可知,與CON組相比,Sa0組草魚(yú)腸道脂肪酶和淀粉酶活性顯著降低(P<0.05);Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道脂肪酶活性顯著高于Sa0組(P<0.05),且Sa800組腸道脂肪酶活性顯著高于Sa200組和Sa400組(P<0.05);Sa800組腸道淀粉酶活性有高于Sa0組、Sa200組和Sa400組的趨勢(shì)(P>0.05);與CON組相比,Sa800組腸道鈉鉀ATP酶活性顯著提高(P<0.05),且有高于Sa0組、Sa200組和Sa400組的趨勢(shì)(P>0.05);與Sa0組相比,Sa800組腸道肌酸激酶活性顯著提高(P<0.05),且有高于CON組的趨勢(shì)(P>0.05)。
表4 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對(duì)草魚(yú)腸道消化酶活性的影響
由表5可知,與CON組相比,Sa0組草魚(yú)腸道超氧化物歧化酶活性和還原型谷胱甘肽含量顯著降低(P<0.05),腸道谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性有降低趨勢(shì)(P>0.05);與Sa0組相比,Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道超氧化物歧化酶活性顯著提高(P<0.05),且與CON組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05),3組之間亦無(wú)顯著差異(P>0.05);與Sa0組相比,Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著提高(P<0.05),且以Sa800組最高;各組之間腸道丙二醛含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表5 低蛋白飼料中添加血根堿對(duì)草魚(yú)腸道抗氧化能力的影響
由圖1可知,與CON組(圖1-a)相比,Sa0組草魚(yú)腸道絨毛稀疏且絨毛出現(xiàn)斷裂損傷(圖1-b)。飼料中添加血根堿后,Sa200組(圖1-c)和Sa400組(圖1-d)腸道絨毛損傷現(xiàn)象得到改善,但排列不整齊;Sa800組(圖1-e)腸道絨毛排列整齊度及密集度均有改善,并且絨毛輪廓清晰??傮w而言,Sa0組、Sa200組、Sa400組和Sa800腸道肌層厚度均優(yōu)于CON組。
a:CON組 CON group;b:Sa0組 Sa0 group;c:Sa200組 Sa200 group;d:Sa400組 Sa400 group;e:Sa800組 Sa800 group。方框表示腸道絨毛斷裂損傷。The box indicated fractured and damaged of intestinal villus.
蛋白質(zhì)是細(xì)胞、組織的重要組成部分,能為水產(chǎn)動(dòng)物提供必需氨基酸和能量,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育有著重要作用[18]。本研究中,與30.00%蛋白質(zhì)組(CON組)相比,28%低蛋白質(zhì)組(Sa0組)草魚(yú)增重率有所降低,這與黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)幼魚(yú)[19]、斷奶仔豬[20]等的研究結(jié)果類(lèi)似,生長(zhǎng)性能降低可能是由于飼料中蛋白質(zhì)水平不能滿足動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需,導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)受阻[12];此外,本試驗(yàn)差異不顯著的原因可能是養(yǎng)殖周期較短且2個(gè)蛋白質(zhì)水平相差較小,未能使草魚(yú)生長(zhǎng)性能出現(xiàn)顯著性差異。血根堿可作為促生長(zhǎng)類(lèi)飼料添加劑[8],在草魚(yú)[21]、錦鯉[14]等的研究中已證實(shí),其可以促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能及機(jī)體免疫力。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致,飼料中添加800 mg/kg血根堿可以提高草魚(yú)增重率和蛋白質(zhì)效率。
魚(yú)類(lèi)生理機(jī)能及健康狀況可從血清生化和免疫指標(biāo)上反映[22]。其中,血清總蛋白含量反映了機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收與代謝情況,血清尿素氮含量反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡[23]。本試驗(yàn)中,低蛋白質(zhì)飼料對(duì)草魚(yú)血清總蛋白和尿素氮含量無(wú)顯著影響,這與車(chē)彥卓等[24]的研究結(jié)果類(lèi)似,說(shuō)明低蛋白質(zhì)飼料對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝影響不大,而飼糧中添加800 mg/kg血根堿使草魚(yú)血清總蛋白和尿素氮含量升高,可能是因?yàn)樵谘鶋A的作用下,機(jī)體新陳代謝得到提高,使得血清尿素氮含量較高,但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。血清總膽固醇和甘油三酯是機(jī)體重要的脂類(lèi)物質(zhì),其含量反映了機(jī)體脂質(zhì)代謝狀況[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低蛋白質(zhì)飼料使草魚(yú)血清總膽固醇和甘油三酯含量降低,可能是由于魚(yú)粉是一種脂肪含量相對(duì)較高的蛋白質(zhì)源,飼料中魚(yú)粉水平降低后,機(jī)體脂肪代謝水平受到影響,而低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后,血清總膽固醇和甘油三酯含量升高,可能是血根堿促進(jìn)了肝臟對(duì)脂質(zhì)的吸收,提升了魚(yú)體脂肪代謝。血液中的葡萄糖是細(xì)胞代謝活動(dòng)的能量來(lái)源[26]。本試驗(yàn)中,與30.00%蛋白質(zhì)組相比,低蛋白質(zhì)飼料使草魚(yú)血清葡萄糖含量降低,說(shuō)明低蛋白質(zhì)飼料會(huì)降低機(jī)體能量代謝水平,而當(dāng)在低蛋白質(zhì)飼料中添加800 mg/kg血根堿時(shí),草魚(yú)血清葡萄糖含量顯著提高,這說(shuō)明血根堿能通過(guò)促進(jìn)魚(yú)體對(duì)糖的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),減少蛋白質(zhì)的消耗,從而發(fā)揮節(jié)約蛋白質(zhì)的作用。以上結(jié)果說(shuō)明,飼料中添加血根堿提高了草魚(yú)對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪和能量的代謝能力。
腸道是魚(yú)類(lèi)進(jìn)行消化吸收的主要場(chǎng)所,腸道消化酶能將飼料中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解為氨基酸、葡萄糖等小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供魚(yú)體吸收,腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性以及消化酶活性對(duì)魚(yú)體消化功能有著重要作用[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低蛋白質(zhì)飼料使草魚(yú)胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及肌酸激酶活性均有所降低,可能的原因是消化酶由消化腺所分泌[27],當(dāng)飼料中蛋白質(zhì)水平降低后,能被消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,導(dǎo)致消化酶的分泌量及活性下降;而在低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后,草魚(yú)腸道消化酶活性有所升高,這與腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相對(duì)應(yīng),草魚(yú)腸道絨毛排列整齊度、密集度及絨毛寬度在800 mg/kg血根堿添加組均有改善,且腸道絨毛無(wú)斷裂損傷現(xiàn)象。這與Liu等[21]的研究結(jié)果類(lèi)似,說(shuō)明血根堿可以通過(guò)提高草魚(yú)腸道消化酶活性,改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu),增大消化吸收面積,加強(qiáng)魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,這也與生長(zhǎng)性能的結(jié)果一致。
魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)平衡可由體內(nèi)多種抗氧化酶維持,當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基過(guò)多時(shí),抗氧化酶活性升高,使氧化應(yīng)激水平降低,從而維持機(jī)體健康[28]。超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶[29];丙二醛主要是活性氧對(duì)多不飽和脂質(zhì)降解的過(guò)氧化產(chǎn)物,其含量越高,機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平越高[19]。有研究表明,飼料中蛋白質(zhì)水平較低時(shí)會(huì)使鯉(Cyprinuscarpio)及鳙(Aristichthysnobilis)肝臟超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性降低,肝臟總抗氧化能力下降[30-31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低蛋白質(zhì)飼料使草魚(yú)腸道超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性降低;楊賀舒等[19]在黃顙魚(yú)中也得到類(lèi)似結(jié)果,說(shuō)明低蛋白質(zhì)飼料會(huì)破壞魚(yú)體氧化還原平衡,使抗氧化酶活性降低。血根堿是一種免疫增強(qiáng)劑,其可以提高動(dòng)物抗氧化能力,有研究已證實(shí),血根堿可提高蛋雞抗氧化能力及免疫功能[32];錦鯉飼料中添加血根堿可提高魚(yú)體生長(zhǎng)性能及免疫應(yīng)答,改善腸道健康[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后,草魚(yú)腸道抗氧化酶活性有所升高,且在添加800 mg/kg血根堿時(shí),草魚(yú)腸道超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性均顯著高于未添加低蛋白質(zhì)組,腸道丙二醛含量則保持較低水平;同時(shí),該組草魚(yú)腸道絨毛無(wú)斷裂損傷現(xiàn)象,絨毛排列整齊度、密集度及絨毛寬度均有改善。這說(shuō)明血根堿可提高魚(yú)體抗氧化能力,改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu),維持機(jī)體健康。推測(cè)可能是因?yàn)檠鶋A能夠抑制佛波醇肉豆蔻酸酯誘導(dǎo)的氧化裂解和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶復(fù)合物活性[33],及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基,降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平,改善腸道組織結(jié)構(gòu),完善機(jī)體防御體系及提升機(jī)體免疫力,但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
低蛋白質(zhì)飼料有使草魚(yú)生長(zhǎng)性能下降的趨勢(shì),而在低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后能夠促進(jìn)草魚(yú)脂肪代謝及對(duì)糖類(lèi)的吸收,提高腸道消化酶活性和抗氧化能力,改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu),且以800 mg/kg添加水平效果較佳。