鄧沛杰 宋澤和 羅國升 劉亞力 蔣小豐 劉自逵* 賀 喜*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南家禽安全生產(chǎn)工程技術中心，長沙 410128；3.湖南普菲克生物科技有限公司，長沙 410128)

壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)也被稱為腸毒血癥，主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，在生產(chǎn)中常與球蟲病相伴或相繼發(fā)生，嚴重降低家禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益[1-3]。近年來，越來越多的國家與地區(qū)開始限制、禁止在畜禽飼料中使用抗生素，為了控制日益提高的雞壞死性腸炎發(fā)病率，抗生素理想替代品的研發(fā)迫在眉睫。目前，抗生素的替代品很多，如益生菌、益生元、多酚、多糖、中草藥等。其中，益生菌具有尤其獨特的優(yōu)勢，如價格低廉、容易獲取、安全無污染等?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)作為我國允許在飼料端直接飼喂的飼用益生菌之一，具有極強的抗逆性及較高的穩(wěn)定性，能很好的在腸道中存活、定植[4]。研究表明，枯草芽孢桿菌進入腸道后，能通過分泌抗菌素、營養(yǎng)競爭等方式抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善生長性能，促進腸道健康，對壞死性腸炎也有一定的治療效果，被廣泛運用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[5-8]。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞生長性能及腸道健康的影響，以期為雞壞死性腸炎的防治和抗生素替代品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌(PFK1702)由湖南某生物科技有限公司提供，活菌數(shù)為1×1010CFU/g。恩拉霉素由湖南某生物科技有限公司提供，有效含量為95%。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CVCC2030)于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心采購。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

選用1日齡雄性愛拔益加(AA)肉雞720只，隨機分成8個組，每組6個重復，每個重復15只雞。試驗采用2×4因子設計，在攻毒與不攻毒的基礎下，分別設置4個飼糧處理，即基礎飼糧、基礎飼糧+300 mg/kg枯草芽孢桿菌、基礎飼糧+500 mg/kg枯草芽孢桿菌、基礎飼糧+12 mg/kg恩拉霉素，具體試驗設計見表1。14日齡時，攻毒組肉雞每只灌喂1 mL卵囊數(shù)為104個/mL的混合型艾美爾球蟲孢子化卵囊磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，非攻毒組肉雞每只灌喂1 mL滅菌PBS。19～21日齡時，攻毒組肉雞連續(xù)3 d經(jīng)口接種培養(yǎng)時間為16 h的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌新鮮菌液(1×108CFU/mL)，每只雞每天接種1 mL，同時非攻毒組肉雞每只灌喂液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG培養(yǎng)基)1 mL。試驗期42 d。肉雞籠養(yǎng)，每籠15只。試驗前將雞舍、料槽、飲水器等徹底清洗、熏蒸消毒。定期打掃并消毒，持續(xù)光照，自由飲水和采食，常規(guī)程序接種。試驗開始雞舍溫度控制在32～34 ℃，第2周降低2 ℃，第3周至試驗結束雞舍溫度控制在25 ℃左右。雞舍相對濕度為50%～60%。

1.3 飼糧組成及營養(yǎng)水平

基礎飼糧采用玉米-豆粕型飼糧，參考《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能

分別于1、21、42日齡時，以重復為單位稱重(稱重前8 h斷料)，并統(tǒng)計耗料量，計算各階段平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每天早、晚觀察試驗雞的健康狀況，一旦發(fā)現(xiàn)死亡，記錄并計算死雞耗料。

1.4.2 血清二胺氧化酶(DAO)活性和脂多糖(LPS)含量

分別于28、35日齡時，每重復隨機抽取1只肉雞，體重接近該重復的平均體重，靜脈采血后分離血清，將血清置于-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。采用試劑盒檢測血清LPS含量和DAO活性，試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司。

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4.3 腸道形態(tài)

取空腸、回腸各1.5 cm，漂洗干凈后固定于4%多聚甲醛中24 h，按照常規(guī)的方法制備成石蠟塊后，切4 μm薄片后蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察腸道絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.4.4 腸道炎癥因子mRNA相對表達量

測定空腸組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、核轉錄因子-κB(NF-κB)的mRNA相對表達量。按照Steady Pure通用型RNA提取試劑盒(購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行空腸組織RNA提取。得到RNA后，按照Evo M-MLV反轉錄試劑盒(購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行，反轉錄得到cDNA，采用SYBR Green(購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。RT-qPCR引物序列見表3，內(nèi)參基因為β-肌動蛋白(β-actin)，采用2-ΔΔCt法對定量結果進行計算分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進行初步處理后，采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中的一般線性模型(GLM)進行雙因素方差分析(two-factor ANOVA)，對差異顯著者進行Turkey多重比較，以P<0.05為差異顯著判斷標準，主效應包括攻毒和飼糧以及二者之間的交互作用。試驗數(shù)據(jù)用平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結 果

2.1 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞生長性能的影響

如表4所示，1～21日齡時，與基礎飼糧相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞的ADG、FBW(P<0.05)；與添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞的ADG、FBW(P<0.05)。22～42日齡時，攻毒顯著提高了肉雞的F/G(P<0.05)；與基礎飼糧和添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞的ADG、FBW(P<0.05)，顯著降低了F/G(P<0.05)。攻毒與飼糧對肉雞22～42日齡F/G的影響存在交互效應(P<0.05)。

2.2 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞血清DAO活性和LPS含量的影響

如表5所示，28日齡時，攻毒顯著提高了肉雞的血清DAO活性(P<0.05)；與基礎飼糧相比，添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著降低了肉雞的血清LPS含量(P<0.05)。35日齡時，攻毒顯著提高了肉雞35日齡的血清DAO活性和LPS含量(P<0.05)。攻毒與飼糧對肉雞28、35日齡血清LPS含量和DAO活性的影響不存在交互效應(P>0.05)。

表3 RT-qPCR引物序列

2.3 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞腸道形態(tài)的影響

如表7所示，28日齡時，攻毒顯著降低了肉雞的空腸和回腸VH、V/C(P<0.05)，顯著提高了肉雞的空腸和回腸CD(P<0.05)；與基礎飼糧相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞的回腸VH(P<0.05)。攻毒與飼糧對肉雞28日齡腸道形態(tài)的影響不存在交互效應(P>0.05)。

如表7所示，35日齡時，攻毒顯著降低了肉雞的空腸和回腸VH、V/C(P<0.05)，顯著提高了肉雞的空腸和回腸CD(P<0.05)；與基礎飼糧相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞的回腸VH(P<0.05)。攻毒與飼糧對35日齡肉雞腸道形態(tài)(除空腸CD)的影響存在交互效應(P<0.05)。

2.4 芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞腸道炎癥因子mRNA相對表達量的影響

如表8所示，28日齡時，攻毒顯著提高了肉雞的空腸TNF-α、IFN-γ、NF-κB、IL-6和IL-12 mRNA相對表達量(P<0.05)；與基礎飼糧相比，添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著降低了肉雞的空腸NF-κBmRNA相對表達量(P<0.05)。攻毒與飼糧對肉雞28日齡空腸NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量的影響存在交互效應(P<0.05)。35日齡時，攻毒顯著提高了肉雞的空腸TNF-α、IFN-γ、NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量(P<0.05)；與基礎飼糧相比，添加12 mg/kg恩拉霉素、300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著降低了肉雞的空腸TNF-α、NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量(P<0.05)。攻毒與飼糧對肉雞35日齡空腸TNF-α、NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量的影響存在交互效應(P<0.05)。

3 討 論

在實際生產(chǎn)中，本試驗所用AA肉雞一般于42日齡時出欄；球蟲攻毒時間常選擇14日齡，在球蟲攻毒后第3～5天進行產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒。研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后第5～9天腸道病變程度逐漸加劇，并在第9天時達到巔峰時，攻毒后第11～14天較第9天有所恢復，在第21天基本恢復完成[9]。因此，本試驗選擇于1、21、42日齡檢測生長性能，于21、35日齡(產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后第7、14天)檢測腸道相關指標。

表4 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞生長性能的影響

表5 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞血清DAO活性和LPS含量的影響

表6 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞28日齡腸道形態(tài)的影響

表7 枯草芽孢桿菌對球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒肉雞35日齡腸道形態(tài)的影響

續(xù)表7項目Items組別 GroupsBDLBSHBSENRABDLBSHBSENRA----++++SEM飼糧 DietsBDLBSHBSENRA攻毒 Attack-+P值 P-value飼糧Diet攻毒Attack交互效應Interactioneffect絨毛高度/隱窩深度 V/C20.27a20.40a16.24ab17.13ab11.67b17.41a15.66ab16.04ab0.5815.9718.915.9516.5818.51a15.20b0.111 0.001 0.020 回腸 Ileum絨毛高度 VH/μm1 064.44a1 068.43a981.77ab1 028.92ab902.43b1 057.65a981.96ab1 011.47a12.70983.44b1 063.04a981.86b1 020.20ab1 035.89a988.38b0.040 0.036 0.039 隱窩深度 CD/μm56.25b59.23b65.66b62.36b85.79a61.06b71.44ab59.39b2.1571.0260.1468.5560.8860.87b69.42a0.108 0.005 0.018 絨毛高度/隱窩深度 V/C20.08a19.06a15.47ab17.06ab10.69b17.72a13.96ab17.43a0.6315.3818.3914.7117.2517.92a14.95b0.062 0.007 0.009

枯草芽孢桿菌作為非致病性益生菌，具有安全性高、適應性強、分泌能力強、易于培養(yǎng)等特點，被廣泛運用于工業(yè)、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等領域[10-12]。研究表明，枯草芽孢桿菌的孢子具有強大的抗逆性和較高的穩(wěn)定性，進入動物胃腸道后被激活而發(fā)揮作用[13]，可以促進動物生長和預防疾病[14]。本試驗中，與基礎飼糧相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著提高了肉雞22～42日齡的ADG、FBW，同時顯著降低了F/G，這與齊博等[15]、張曉慧[16]的報道一致。與基礎飼糧相比，添加枯草芽孢桿菌對肉雞1～21日齡的ADFI有顯著影響，對22～42日齡的ADFI無顯著影響，這與Hadieva等[17]的結果不一致，可能與雞的品種、枯草芽孢桿菌制劑狀況、飼養(yǎng)條件等有關。本試驗中，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能的效果與添加12 mg/kg恩拉霉素差異不明顯，但優(yōu)于添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌：與添加500 mg/kg枯草芽孢桿菌相比，添加300 mg/kg枯草芽孢桿菌后肉雞具有更高的ADG和FBW，且22～42日齡時具有更低的F/G，具體機制有待進一步研究。前人研究表明，壞死性腸炎降低肉雞生長性能[18]。本試驗中，攻毒提高了肉雞的F/G，對肉雞的FBW、ADFI無顯著影響，與夏億等[19]的報道有所不同，這或許與壞死性腸炎的嚴重程度、雞只品種、飼養(yǎng)條件等有關。雞壞死性腸炎分為臨床(急性)和亞臨床(亞急性)形式，其中亞臨床型雞壞死性腸炎在實際生產(chǎn)更為常見，主要表現(xiàn)為生長速率和飼料轉化率的降低[20]。此外，3～4周齡后，肉雞肌肉開始快速生長，肉雞為了滿足體重的快速增長和巨大的營養(yǎng)需求而提高采食量，這可能掩蓋了攻毒對肉雞采食量及增重的影響?？莶菅挎邨U菌可通過分泌多種細菌素和抗菌肽[21-22]、營養(yǎng)競爭等方式抑制有害菌的繁殖，從而緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌對生產(chǎn)性能的降低[23]。本研究中，飼糧中添加枯草芽孢桿菌緩解了球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒對肉雞F/G的影響，與前人研究結果一致。

DAO是在動物中廣泛存在的一種細胞內(nèi)酶，主要分布于腸道黏膜細胞中，在血液中含量很少。當腸黏膜受損時，DAO從細胞中釋放處出來，進入血液中，所以血清DAO活性的測定是反映腸道屏障完整性和受損程度的重要指標[24]。LPS是革蘭氏陰性菌的一種結構成分，雖然產(chǎn)氣莢膜梭菌是革蘭氏陽性菌，但產(chǎn)氣莢膜梭菌感染會破壞腸道屏障完整性，引起大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的過度增殖，細菌通過受損的腸黏膜進入血液中，引起血清LPS含量的提升[25-26]。所以血清LPS含量可以一定程度上反映細菌感染和腸黏膜損傷情況。本試驗中，攻毒組肉雞血清DAO活性上升，LPS含量提高，說明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，腸黏膜受損，腸道屏障的完整性被破壞，細菌及細菌成分進入了血液中。

營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所是小腸,小腸腸道形態(tài)直接影響家禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。腸道形態(tài)通常用VH、CD及V/C來衡量。VH越高，吸收面積越大，營養(yǎng)物質(zhì)吸收效率越高，而CD代表腸道細胞的成熟率，CD越淺代表細胞成熟率越高，分泌能力越強。V/C整體衡量腸道的消化吸收能力，V/C越高，消化吸收能力越強。袁文菊等[27]在飼糧中添加枯草芽孢桿菌，顯著提高了肉雞空腸的VH和V/C，降低了CD。本試驗中，與基礎飼糧相比，添加枯草芽孢桿菌提高了回腸的VH，也有降低回腸CD和提高V/C的趨勢，說明枯草芽孢桿菌可以改善腸道形態(tài)，增強肉雞的營養(yǎng)吸收功能。孟禹璇等[28]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染顯著降低肉雞23日齡肉雞十二指腸的V/C和30日齡肉雞回腸VH。劉陽等[29]用產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞，提高了23日齡肉雞十二指腸CD，并降低了肉雞十二指腸和回腸VH、十二指腸的V/C。本試驗中，球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒降低了空腸和回腸的VH、V/C，提高了CD，說明攻毒會降低肉雞的營養(yǎng)吸收功能，這前人的研究結論不完全一致，可能是菌株種類、攻毒方式、采樣時間及部位等有關。添加枯草芽孢桿菌后，攻毒肉雞35日齡的回腸的CD顯著降低，28、35日齡的空腸、回腸的VH、V/C顯著提高，與對照組相比無顯著差異，說明飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以緩解球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒對肉雞腸道形態(tài)的不利影響。

炎癥因子即參與炎癥反應的各種細胞因子?？漳c是雞壞死性腸炎主要病變部位之一，空腸炎癥因子的表達可以一定程度上反映雞壞死性腸炎的情況。TNF-α、IL-6、IL-12是巨噬細胞分泌的炎癥因子。IFN-γ由巨噬細胞或自然殺傷(NK)細胞產(chǎn)生，常見于病毒、細菌感染，與炎性疾病嚴重程度相關。NF-κB是重要轉錄因子，NF-κB信號通路可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達[30]。倪學勤等[31]研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒提高了肉雞回腸IL-6、IFN-γmRNA相對表達量。也有研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌與球蟲混合感染提高了回腸IFN-γmRNA相對表達量[32]。本試驗中，產(chǎn)氣莢膜梭菌與球蟲混合攻毒提高了空腸TNF-α、IFN-γ、NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量。有研究表明，LPS通過激活NF-κB信號通路誘導炎癥因子TNF-α、IL-6等的表達[33]。本試驗中，攻毒引起血清LPS含量的提升，與攻毒引起TNF-α、NF-κB和IL-6 mRNA相對表達量提高相互印證。飼糧中添加枯草芽孢桿菌，攻毒肉雞TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA相對表達量顯著降低，與對照組無顯著差異，說明添加枯草芽孢桿菌緩解了攻毒對肉雞炎癥因子表達量的影響。這可能是枯草芽孢桿菌抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，緩解了腸黏膜損傷，加速損傷的修復。

4 結 論

① 飼糧中添加枯草芽孢桿菌提高了肉雞生產(chǎn)性能，改善了腸道健康，緩解了球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合攻毒對肉雞生長性能、腸道健康的不良影響。

② 飼糧中添加300 mg/kg的枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能的效果優(yōu)于添加500 mg/kg枯草芽孢桿，與添加12 mg/kg恩拉霉素效果相近。