黃泰來 金 睿 溫建崇 譚 華 雷華英 曹滿湖*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.湖南今漢藥業(yè)有限公司，長沙 410300；3.麻陽藍鳳凰農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，懷化 419400)

肉雞腹部脂肪過量沉積是影響肉品質和商品性狀的重要因素，開發(fā)具有降脂作用的飼料添加劑對家禽具有重要意義和生產(chǎn)價值。桑樹是我國南方種植廣泛的一種植物[1]，其提取物含有酚類、黃酮類、生物堿、氨基酸、多糖和甾類化合物等多種生物活性化合物，具有降血糖、降血壓、降血脂，抗氧化、抗炎等作用[2-3]。其中，桑葉中黃酮類和其特有生物堿成分1-脫氧野尻霉素(DNJ)被證明在調控糖脂代謝中作用顯著。研究表明，DNJ可改善Ⅱ型糖尿病小鼠肝細胞細胞核病變，并將小鼠尿液中16種代謝產(chǎn)物逐漸恢復接近正常水平，有效抑制了葡萄糖苷酶活性、脂肪代謝和氨基酸代謝[4]。Hu等[5]通過大鼠試驗以及細胞試驗驗證，發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮可通過減少體內外過高的膽固醇積累治療肝臟類疾病。肉雞脂肪代謝與脂肪的合成、分解和轉運等多個過程有關，其調控機制相對復雜且涉及多條信號通路，其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路被證明與機體脂質代謝密切相關，但在肉雞腹脂沉積的研究中較少。此外，關于桑葉提取物對肉雞腹脂沉積的影響及作用途徑的研究也鮮有報道。因此，本研究擬通過在飼糧中添加桑葉提取物，考察其對肉雞腹脂沉積的影響，并通過其對生長性能、血清和肝臟中脂肪代謝相關指標和基因表達的影響，初步探討其作用機制，為桑葉提取物在肉雞生產(chǎn)上的應用提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑葉提取物由湖南某有限公司提供(批號：MD0.5-200519)，提取方式為水提取，簡要步驟如下：桑葉加7.5倍水，提取3次，提取液濃縮，合并濃縮液，醇沉，濃縮揮醇，噴霧干燥，過篩，混合即得。其主要成分及含量如下：多糖5%、總黃酮20%、總酚25%、DNJ 0.5%、總蛋白質30%、粗脂肪2.5%、總灰分15%、水分1.2%、粗纖維0.5%,其他成分0.3%。

愛撥益加(AA)肉仔雞：由湖南順成實業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗選用1日齡AA肉雞192只，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復8羽。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別飼喂在基礎飼糧中添加400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物的飼糧。試驗期為56 d，分為1～21日齡(前期)和22～56日齡(后期)2個階段?；A飼糧參照《肉雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)和NRC(1994)肉雞營養(yǎng)需要標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

續(xù)表1項目Items1～21日齡 1 to 21 days of age22～56日齡 22 to 56 days of age魚粉 Fish meal1.502.28大豆油 Soybean oil2.173.22DL-蛋氨酸 DL-Met0.180.10磷酸氫鈣 CaHPO41.381.09石粉 Limestone1.151.21食鹽 NaCl0.300.30預混料 Premix1)1.001.00合計 Total100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)12.5412.96粗蛋白質 CP21.5019.50賴氨酸 Lys1.171.02蛋氨酸 Met0.530.43鈣 Ca1.000.95有效磷 AP0.450.40

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間自由采食和飲水，日常管理參照《商品肉雞生產(chǎn)技術規(guī)程》(GB/T 19664—2005)。

1.4 樣品采集

血液樣品采集：在21和56日齡，每個重復隨機選取1只健康的肉雞，頸靜脈采集血樣，用離心機離心分離血清待測。

肝臟樣品采集：在21和56日齡，每個重復隨機選取1只健康的肉雞，肝臟樣本保存在液氮中，測定時稱取肝臟樣品0.1 g，用無水乙醇勻漿，3 000 r/min離心15 min，使肝臟與無水乙醇比例為1∶9，取上清用于肝臟生化指標檢測；其余肝臟樣品于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)基因表達的檢測。

1.5 測定指標

1.5.1 生長性能

在1日齡時，稱取初始體重。在21和56日齡時，空腹12 h后(停料不停水)，稱量統(tǒng)計各重復雞體重，計算各重復各階段的耗料量、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 腹脂沉積

腹脂沉積以腹脂沉積量來表示，計算公式如下：

腹脂沉積量(g/kg)=腹脂重(g)/肉雞活重(kg)。

1.5.3 血清和肝臟生化指標

使用全自動生化儀(邁瑞B(yǎng)S系列)測定血清和肝臟中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.5.4 肝臟中脂肪代謝相關基因表達

提取肉雞肝臟組織中總RNA，反轉錄，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定基因mRNA相對表達量。RNA提取試劑盒(AG21017)、反轉錄試劑盒(AG11706)、RT-qPCR試劑盒(AG11701)均購自艾科瑞生物工程有限公司。試驗操作嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行，反應體系為10 μL，于(Roche)LightCycler 2.0熒光定量儀上測定。試驗測定肝臟中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇類調節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)、肉堿棕櫚酰轉移酶-1α(CPT-1α)、脂酰輔酶A氧化酶(ACO)、脂蛋白分解酶(LPL)、肝臟型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的mRNA相對表達量，相關引物序列見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，采用2-△△Ct法定量上述目的基因的mRNA相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葉提取物對肉雞生長性能的影響

由表3可見，與對照組相比，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 桑葉提取物對肉雞腹脂沉積量的影響

由表4可見，與對照組相比，飼糧中添加400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物在21、56日齡時均顯著降低了肉雞的腹脂沉積量(P<0.05)，其中56日齡腹脂沉積量的下降比率分別為30.38%、36.32%、44.90%，但3個添加水平間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 桑葉提取物對肉雞血清和肝臟生化指標的影響

2.3.1 桑葉提取物對肉雞血清生化指標的影響

由表5可見，在21和56日齡時，與對照組相比，飼糧中添加不同水平的桑葉提取物對肉雞血清TG、GLU、HDL-C和LDL-C含量均無顯著影響(P>0.05)，添加800 mg/kg桑葉提取物可顯著降低21日齡肉雞血清中TC含量(P<0.05)，添加1 200 mg/kg桑葉提取物可顯著降低21和56日齡肉雞血清中TC含量(P<0.05)。

表3 桑葉提取物對肉雞生長性能的影響

表4 桑葉提取物對肉雞腹脂沉積量的影響

2.3.2 桑葉提取物對肉雞肝臟生化指標的影響

由表6可知，在21和56日齡時，與對照組相比，飼糧中添加不同水平的桑葉提取物對肉雞肝臟中TG含量無顯著影響(P>0.05)，但添加800、1 200 mg/kg桑葉提取物可顯著降低肉雞肝臟中TC的含量(P<0.05)。

表5 桑葉提取物對肉雞血清生化指標的影響

表6 桑葉提取物對肉雞肝臟生化指標的影響

2.4 桑葉提取物對肉雞肝臟脂質代謝相關基因mRNA相對表達量的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧中添加桑葉提取物均顯著增加了肉雞肝臟中AMPKα的mRNA相對表達量(P<0.05)；添加800、1 200 mg/kg的桑葉提取物顯著降低了肝臟中脂肪酸合成中SREBP-1c、ACC和FAS的mRNA相對表達量(P<0.05)；但3個添加組間肝臟中PPARα、CPT1α、ACO、LPL、L-FABP的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

表7 桑葉提取物對肉雞肝臟中脂質代謝相關基因表達的影響

3 討 論

桑葉及其提取物對生長性能的影響與其添加的形式有關，桑葉在動物生產(chǎn)上的應用目前主要有桑葉粉、發(fā)酵桑葉和提取物幾種。黃靜等[6]研究表明，隨著添加水平的提高，桑葉粉組和發(fā)酵桑葉粉組使胡須雞的ADG、ADFI逐漸降低。張金龍等[7]的研究表明，飼喂肉雞2%的發(fā)酵桑葉粉可以顯著提高肉雞(羅斯308)ADFI和ADG，但對F/G無顯著影響。宋瓊莉等[8]在矮腳黃雞飼糧中添加0.2%、0.5%、0.8%的桑葉提取物，各桑葉提取物組的ADG均顯著提高，但均有降低F/G的趨勢。本試驗結果表明，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均無顯著影響。造成上述研究結果差異的原因可能是桑葉提取物相較桑葉粉，其功能性成分(黃酮、酚類生物堿等)含量更多，而抗營養(yǎng)因子含量較少有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物可顯著降低AA肉雞的腹脂沉積量，這與目前桑葉及其提取物在家禽上的其他研究結果類似。李瑞雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉粉極顯著降低了皖西白鵝的腹脂率。蘭翠英等[10]的研究表明，飼糧中添加5%、8%、10%的桑葉粉可降低肉雞腹脂率，其中5%桑葉粉添加量可降低腹脂率達39.81%。本研究結果證明，400、800和1 200 mg/kg桑葉提取物可降低AA肉雞的腹脂沉積量分別達30.38%、36.32%、44.90%，這證明桑葉提取物對AA肉雞腹脂沉積有降低作用。

血清和骯臟中與脂肪代謝相關生化指標的試驗結果表明，飼糧中添加800、1 200 mg/kg桑葉提取均顯著降低了肉雞前期和后期血清和肝臟中TC含量，但其他指標，如TG、LDL-C和GLU的含量均無顯著影響，表明桑葉提取物可能通過減少膽固醇在肝臟和血清中的含量，實現(xiàn)降低AA肉雞腹脂沉積的作用。脂肪主要分為TG、TC、脂肪酸和類脂質。TG是機體儲存能量的主要形式，血清TG含量代表了動物脂肪沉積的能力；膽固醇主要合成和儲存于肝臟，血清TC含量是血液中脂蛋白所含膽固醇的總和，可作為脂肪代謝的主要指標；血清LDL-C合成于肝臟，是血液轉運肝臟合成的內源性膽固醇運至肝外組織的重要脂蛋白，是保證機體對膽固醇的需要的重要載體。另外，肝臟TC、TG也是反映肝臟中脂肪代謝的重要指標。肝臟中脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)對于機體健康至關重要，當體內脂肪和膽固醇過多時，則不能被完全代謝，并大量沉積在肝臟和腹部[11]，導致脂肪肝和腹部脂肪沉積[12-13]。本研究結果與桑葉及其加工產(chǎn)物在其他動物生產(chǎn)上的應用基本一致。樊路杰[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉或發(fā)酵桑葉可極顯著降低育肥豬血清TC、TG、LDL-C的含量，極顯著提高血清中HDL-C的含量，表明桑葉和發(fā)酵桑葉可以提高育肥豬脂肪代謝能力，Lee等[15]在小鼠中也有類似發(fā)現(xiàn)。黃靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加20%的桑葉粉可顯著降低胡須雞血清中TC、TG含量。侯啟瑞等[16]的研究結果顯示，桑葉粉和桑葉DNJ提取物顯著降低了鵝血液中的TG含量，但對血液中TC、LDL-C和HDL-C含量無顯著影響，提示DNJ是桑葉中影響動物脂肪代謝的重要功效物質，而本試驗中所使用的桑葉提取物中也含有DNJ，這可能是其有效降低AA肉雞腹脂沉積的功能性物質之一。

進一步對肝臟中與脂肪代謝合成與分解途徑相關基因的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物對AA肉雞腹脂沉積、血清和肝臟中TC含量的降低，與肝臟中脂肪酸合成過程中的AMPK信號路徑有關，而與分解途徑相關性不大。

AMPK作為機體調控能量和脂類代謝的重要信號路徑，可通過直接磷酸化SREBP-1c的相應靶點，從而下調SREBP-1c基因的表達，起到抑制脂肪的合成作用[17-18]。而SREBP-1c作為細胞中脂肪代謝主要轉錄調控因子，可直接調控ACC和FAS等脂肪合成相關酶的基因表達水平，調節(jié)脂肪酸和TG合成，具有生脂作用。如對小鼠的研究表明，SREBP-1c基因的過表達可促進肝臟中TG和膽固醇的沉積[19]。FAS是長鏈脂肪酸聚合過程中的關鍵酶，與肝臟脂肪酸合成密切相關[20]；ACC在調節(jié)機體脂肪酸合成和代謝方面起著重要作用，抑制ACC的活性可起到減少機體中脂肪合成、增強脂肪酸氧化的效果[21]。本研究結果顯示，桑葉提取物顯著上調了肉雞肝臟中AMPKα的mRNA相對表達量，下調了SREBP-1c、ACC、FAS的mRNA相對表達量，有效減少了肝臟中膽固醇的沉積。該結果提示，桑葉提取物發(fā)揮降低AA肉雞腹脂沉積的功效可能是通過AMPKα的激活，經(jīng)過AMPK/SREBP-1c/ACC信號通路，降低ACC和FAS等相關酶的表達，通過減少肝臟中的脂肪酸合成，從而降低肉雞血脂和腹脂沉積，如圖1所示。

AMPKα:腺苷酸活化蛋白激酶α AMP-activated protein kinase α;SREBP-1c:固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c sterol regulatory element binding protein-1c;ER:內質網(wǎng) endoplasmic reticulum;SRE:啟動子區(qū)域SRE元件 promoter region SRE element; FAS:脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase; ACC:乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase;TC:總膽固醇 total cholesterol。

在脂肪酸氧化分解方面，本試驗檢測了轉錄因子PPARα及其調控的相關基因ACO、CPT1α、LPL和L-FABP的mRNA相對表達量。PPARα屬于核激素受體家族，能夠通過促進脂肪酸β氧化和調節(jié)脂蛋白代謝來發(fā)揮調控機體脂肪代謝的作用。PPARα可通過調控CPT1α和ACO等的基因表達和酶活性，從而調節(jié)機體內β氧化[22]。在嚙齒動物中，PPARα可通過多種機制改善胰島素抵抗，增強胰島素敏感性，進一步增強肝臟脂肪酸氧化酶表達水平來實現(xiàn)降脂作用[23]。代泓鈺等[24]的研究表明，桑葉水提物可能通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蘇氨酸激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體α/肉堿棕櫚酰轉移酶-1(PI3K/Akt/PPARα/CPT-1)信號通路有效改善大鼠肝臟糖、脂代謝和胰島素抵抗。Tang等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉水提物可通過激活AMPK和PPARα信號通路減少小鼠肝臟脂質合成和累積，對酒精誘導的肝臟損傷具有保護作用。

但本研究結果顯示，飼糧中添加桑葉提取物對肉雞肝臟中PPARα、CPT1α、ACO、LPL和L-FABP等mRNA相對表達量無顯著影響。這表明與嚙齒動物不同，桑葉提取物在家禽中實現(xiàn)降脂功效主要是通過抑制脂肪酸的合成[21,26]，而非通過脂肪的氧化分解來實現(xiàn)的。

4 結 論

綜上所述，桑葉提取物有效減少AA肉雞腹脂的沉積，其作用原理與AMPK/SREBP-1c/ACC信號通路有關，通過上調肝臟中AMPKα的基因表達和下調SREBP-1c及其下游與脂肪酸合成相關酶FAS、ACC的基因表達，通過減少肝臟和血清中膽固醇含量，從而實現(xiàn)降低肉雞腹脂沉積的作用。本試驗中，桑葉提取物對AA肉雞發(fā)揮降脂作用的適宜添加量為800～1 200 mg/kg。