林標聲 何玉琴，2 謝璐娜 周孝瓊 羅 建 李 焰,2 戴愛玲，2*

(1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364000；2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，龍巖 364000；3.福建省龍巖市動物疫病預(yù)防控制中心，龍巖 364000；4.福建龍巖金和動物飼料有限公司，龍巖 364000)

隨著減抗、無抗時代的來臨，更多的抗生素替代品被大量應(yīng)用在動物飼糧中，其中菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料作為一種新型的綠色飼料添加劑在“禁抗替抗”中具有良好的應(yīng)用前景。菌酶協(xié)同發(fā)酵其微生物益生菌與酶解技術(shù)相結(jié)合的功能，是發(fā)酵飼料重大的技術(shù)突破點，是將來生物飼料發(fā)展的一個重要方向[1]。大量研究證實，在飼糧中添加復(fù)合酶特別是非淀粉多糖酶(NSP)對畜禽生產(chǎn)及品質(zhì)具有積極的影響。研究表明，在肉雞飼糧中添加NSP，能彌補機體分泌NSP不足的缺陷，消除NSP的黏度效應(yīng)，間接提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，從而促進肉雞生長[2-3]。另有報道表明，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料能夠促進雞腸上皮細胞的形成，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，維持腸道微生態(tài)平衡，改善雞的腸道健康并預(yù)防腸道病原菌感染[4]。但已有的研究中探討菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料影響畜禽生長及腸道功能的機理研究報道較少。

此外，隨著人們生活水平的提高，消費者越來越注重雞肉的質(zhì)量，對肉質(zhì)有了更高的要求。然而，隨著動物生產(chǎn)性能的不斷提高，其風味品質(zhì)呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢[5-6]。因此，既能充分發(fā)揮肉雞的生長潛力又能夠改善雞肉風味品質(zhì)的各類型發(fā)酵飼料添加劑在肉雞飼養(yǎng)中越來越受到人們的重視。研究表明，發(fā)酵飼料通過好氧厭氧發(fā)酵對底物進行深層發(fā)酵，對肉雞的生長性能、消化代謝、肉品質(zhì)、肌肉脂肪酸組成等方面均有不同程度的改善，還能顯著提高肉雞的屠宰率、腿肌率以及胸肌率[7]。

高通量測序已經(jīng)成為一種常規(guī)的試驗技術(shù)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄水平和腸道菌群分析等。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)通過高通量測序來全面快速地獲得特定細胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄的序列信息和表達信息，準確地分析基因的表達差異[8]；而基于16S rRNA基因高通量測序已成為動物腸道菌群組成及多樣性分析的常用技術(shù)[9]。因此，本研究將河田雞作為研究對象，研究菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞肌肉風味物質(zhì)含量、腸道轉(zhuǎn)錄組及菌群組成的影響，探討其作用肉雞腸道功能的機理，以期為菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料在肉雞生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NSP組成及其活性：木聚糖酶活性10 000～20 000 U/g，β-葡聚糖酶活性1 000～1 500 U/g，甘露聚糖酶活性200～300 U/g，纖維素酶活性2 000～4 000 U/g，果膠酶活性100～300 U/g。

發(fā)酵裝置：選擇帶有單向透氣孔的PE膜，該膜5～7層厚，透氣口徑9～12 mm，透氧量2.25～4.42 cm3/(m2·d·Pa)，排氣壓力6 644～7 350 Pa。

菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料：采用某公司自動化生產(chǎn)工藝設(shè)備進行生產(chǎn)，具體流程如下：1)發(fā)酵復(fù)合菌株(乳酸菌6.2×109～7.7×109CFU/g、酵母菌3.3×108～4.6×108CFU/g和芽孢桿菌2.5×108～4.2×108CFU/g的復(fù)合菌劑)提前用25～30 ℃紅糖水活化；2)發(fā)酵原料(玉米、豆粕、麩皮、糖蜜豆皮、米糠粕)與1.0%復(fù)合多維、0.07% NSP和前述活化好的發(fā)酵復(fù)合菌株共同混合，并補充水分至30%，攪拌均勻；3)混合好的物料裝入帶有單向透氣孔的PE膜袋中密封，在25 ℃下發(fā)酵5～7 d得成品。發(fā)酵產(chǎn)品中主要營養(yǎng)成分含量：粗蛋白質(zhì)≥16.0%、粗纖維12.5%、粗灰分≤12.0%、有機酸≥13.8%、酸溶蛋白12.0%、鈣2.5%～3.5%、總磷≥10.1%、氯化鈉0.1%～0.8%、賴氨酸≥0.35%，最終活菌總數(shù)7.3×109～8.1×109CFU/g。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗在福建省長汀縣眾益農(nóng)牧有限公司飼養(yǎng)的長汀河田肉雞養(yǎng)殖場內(nèi)進行。試驗選取體重相近、健康無病的60日齡河田肉雞18 000羽，隨機分為2組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1 500羽，飼養(yǎng)于單層平養(yǎng)雞籠內(nèi)。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(組成及營養(yǎng)水平見表1)，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加5.0%菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料，混合均勻飼喂，試驗期90 d。自由采食，自由飲水，飼養(yǎng)管理按場內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)規(guī)程進行。試驗結(jié)束后，每組隨機選取體重相似的肉雞6只(每個重復(fù)1只)進行屠宰，取左側(cè)胸肌、髂脛外側(cè)肌同一部位的腿肌樣品用于風味物質(zhì)含量測定。再用無菌剪刀將所屠宰的6組肉雞分別沿腹底部向上剖開腹腔，剪切雞的整個腸道，其中3組整個腸道分別裝入無菌封口塑料袋中；另外3組腸道再分別剪切下十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸組織，挑起各腸道內(nèi)容物于無菌離心管中。2類樣品均先液氮預(yù)凍-80 ℃保存，再用干冰運輸送至北京奧維森基因科技有限公司，整個腸道樣品用于轉(zhuǎn)錄組測序，各腸道不同區(qū)段內(nèi)容物用于菌群組成分析。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 風味物質(zhì)含量的測定

分別使用氨基酸分析儀(茚三酮衍生系統(tǒng)，蘭博PCR3+)和全自動凱氏定氮儀(海能K1160)參照中國食品安全國家標準食品中GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法測定肌肉中的氨基酸和蛋白質(zhì)含量；采用高效液相色譜儀(安捷倫 1260)參照GBDB 37/T 3816—2019 《畜禽肌肉中肌苷酸含量測定 高效液相色譜法》和GB 5009.169—2016《食品中?；撬岬臏y定》的方法測定肌肉中的肌苷酸和?；撬岷?；采用氣相色譜儀(Agilent Technologies 7890B)參照GB 5009.128.2016《食品中膽固醇的測定》和GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》的方法測定肌肉中膽固醇和不飽和脂肪酸含量；以上指標測定均送至中國廈門譜尼測試有限公司檢測。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析

將2組肉雞整個腸道樣本分別放置液氮中，邊研磨邊粉碎，再取粉碎后部分樣品采用RNA 6000 Nano Kit試劑盒(Agilent公司，型號5067-1511)提取總RNA，通過Nanodrop和Agilent 2100檢測RNA純度[吸光度(OD)260/280、OD260/230]及RNA片段長度，樣品檢測合格后委托北京奧維森基因科技有限公司完成文庫的構(gòu)建和測序工作，建好的測序文庫采用Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。去除帶有測序接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的測序原始數(shù)據(jù)后，采用Tophat2軟件將測序序列和轉(zhuǎn)錄組序列進行比對，隨后采用Cufflinks軟件組裝比對結(jié)果，對測序結(jié)果進行RNA-Seq相關(guān)性檢查。采用HTSeq軟件對各樣品進行基因表達水平的分析，使用FPKM值為1作為判斷基因是否表達的闕值，只分析FPKM>1的基因[10]，并使用DESeq進行差異表達分析，篩選條件為qvalue<0.05[11]?；赪allenius non-central hyper-genometic發(fā)布的方法，通過GOseq軟件對差異表達基因(DEGs)進行GO富集分析[12]；將測序結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，通過超幾何檢驗，找出差異表達基因當中最顯著富集的通路，對差異表達基因進行功能注釋和分類[13]。

1.5 腸道菌群分析

分別取3組雞腸道十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸組織內(nèi)容物，采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(100)提取其細菌總DNA。獲得總DNA后委托北京奧維森基因科技有限公司進行具體分析工作，采用Miseq PE300高通量測序平臺進行建庫，應(yīng)用16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行高通量測序，經(jīng)過濾數(shù)據(jù)中的嘈雜序列，去雜、拼接獲得高質(zhì)量有效序列再通過Usearch軟件，按照97%的相似度CD-HIT分類方法進行操作分類單元(OTU)聚類，以豐度最大的序列為代表序列通過RDP Classifier與GreenGene數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進行物種注釋(闕值為0.8～1.0)[14]，計算OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao l指數(shù)等α多樣性指數(shù)[15]，并進行主成分分析(PCA)(R軟件，vegan包)[16]和線性判別分析(LEFSe)(LDA score>4)[17]，探討腸道各區(qū)段菌群組成的差異性。

1.6 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，采用Statistics 17.0軟件中的Independent-SampletTest獨立樣本的t檢驗分析試驗組與對照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞肌肉風味物質(zhì)含量的影響

由表2可知，與對照組相比，試驗組肉雞的各項風味物質(zhì)含量均有增長或改善，其中，試驗組胸肌的總氨基酸、風味氨基酸、肌苷酸、不飽和脂肪酸含量和腿肌的總氨基酸、風味氨基酸、蛋白質(zhì)、膽固醇、牛磺酸和不飽和脂肪酸含量差異均達顯著水平(P<0.05)，表明菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞肌肉風味具有良好的改善作用。

表2 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞肌肉風味物質(zhì)含量的影響

續(xù)表2 項目 Items胸肌 Chest muscle對照組 Control group試驗組 Test group腿肌 Leg muscle對照組 Control group試驗組 Test group膽固醇 Cholesterol0.044±0.0000.042±0.0010.074±0.0010.037±0.000??；撬?Taurine0.064±0.0010.067±0.0020.254±0.0100.278±0.021?不飽和脂肪酸 Unsaturated fatty acids0.43±0.050.68±0.06?0.83±0.031.57±0.02?

2.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞腸道轉(zhuǎn)錄組的影響

2.2.1 樣品測序質(zhì)量評估

對照組和試驗組各樣品總RNA提取效果較好，其OD260/280在2.027～2.063，OD260/230在1.450～2.254，RNA完整值(RIN)在9.8～10.0，28S/18S在2.2～4.0，樣品質(zhì)量滿足建庫測序要求。RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將構(gòu)建好的cDNA文庫，通過Illumina HiSeq 4000測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序得到的下機數(shù)據(jù)去除帶有接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量超過50% reads的原始序列，得到質(zhì)控序列(clean reads)。6個樣本均獲得了7.00 G以上容量的原始數(shù)據(jù)，GC含量都在50.00%以上，平均錯誤率均為0.03%，Q20與Q30分別都在97.00%及93.00%以上(表3)，表明轉(zhuǎn)錄組測序所獲得數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。2組樣本之間的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.960，表明結(jié)果可靠且樣本選擇合理(圖1)。

表3 2組樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量檢驗結(jié)果

2.2.2 差異表達基因篩選

對基因表達量進行表轉(zhuǎn)化處理后，根據(jù)|log2(fold change)|>1且qvalue<0.05的原則篩選差異表達基因。與對照組比較，試驗組共篩選出7 751個差異表達基因，其中試驗組有3 833個基因上調(diào)表達(圖2-A)，占總差異表達49.45%，3 918個基因下調(diào)表達，占總差異表達50.55%。以FPKM>1作為判斷基因表達的標準，2個樣品共同表達基因13 089個，試驗組特有的表達基因363個(圖2-B)。

2.2.3 上調(diào)差異表達基因GO富集

對2組樣品差異表達基因進行GO富集分析，結(jié)果顯示，總共有12 782個上調(diào)差異表達基因被富集到3 167個GO term。對富集最顯著的30個GO term功能富集分析表明，富集的基因條目集中在與生物過程(biological process)相關(guān)的條目，個別在細胞組成(cellular component)相關(guān)的條目。在生物過程類別中，富集到差異表達基因最多的類別是對壓力的反應(yīng)(response to stress)、免疫系統(tǒng)過程(immune system process)和免疫反應(yīng)(immune response)(圖3)。

CK1、2、3和TG1、2、3分別為對照組和試驗組樣品。CK1, 2, 3 and TG1, 2, 3 were samples in control and test groups, respectively.

2.2.4 上調(diào)差異表達基因KEEG富集

2組樣品上調(diào)差異表達基因KEEG富集分析表明，共有2 772個基因被注釋到162條KEGG代謝通路中，其中2組富集最顯著的20條KEGG代謝通路如圖4所示。與新陳代謝有關(guān)的信號通路11個，包括脂肪細胞因子信號通路(adipocytokine signaling pathway)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、次級代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、氨基酸的生物合成(biosyn-thesis of amino acids)、嘌呤代謝(purine metabo-lism)、N-聚糖生物合成(N-glycan biosynthesis)、2-氧羰基酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)、賴氨酸生物合成(lysine biosynthesis)、氨酰tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，其中富集差異表達基因數(shù)目最多的信號通路為次級代謝產(chǎn)物的生物合成，共富集到差異表達基因66個，與對照組差異顯著(P<0.05)；富集程度最高的信號通路是氨基酸的生物合成，共富集到差異表達基因13個，與對照組差異顯著(P<0.05)。與免疫有關(guān)信號通路9個，包括NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、甲型流感(influenza A)、單純皰疹病毒1型感染(herpes simplex virus 1 infection)、吞噬體(phagosome)、胞漿DNA感應(yīng)途徑(cytosolic DNA-sensing pathway)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、C型凝集素受體信號通路(c-type lectin receptor signaling pathway)、細胞黏附分子(cell adhesion molecules)和凋亡(apoptosis)，其中富集差異表達基因數(shù)最多的信號通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)，共富集到差異表達基因80個，與對照組差異顯著(P<0.05)；富集程度最高的信號通路是吞噬體(phagosome)，共富集到差異表達基因16個，與對照組差異顯著(P<0.05)。

圖2 2組樣品差異表達基因火山圖(A)和韋恩圖(B)

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對肉雞腸道菌群組成的影響

2.3.1 肉雞腸道菌群Alpha多樣性分析

通過對測序所得的序列進行預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列和冗余序列，2組樣品30個樣本Index完全匹配的有效序列量見表4所示。各樣本菌群組成差異性較大，2組腸道各區(qū)段菌群的數(shù)量均為盲腸>直腸>回腸>空腸>十二指腸；與對照組相比，試驗組各對應(yīng)腸道區(qū)段OTUs數(shù)目和Chao1指數(shù)增加，表明各樣本的菌群數(shù)量增加；試驗組各對應(yīng)腸道區(qū)段Shannon和Simpson指數(shù)略小于對照組，表明各樣本的菌群的種類略有下降?？傊嫔l(fā)酵飼料的添加改變了肉雞腸道不同區(qū)段的微生物菌群組成。

圖3 上調(diào)差異表達基因的GO功能富集分析

從細菌的有效序列長度圖可以看出，細菌序列主要分布在400～440 bp(圖5-A)。利用Mothur軟件做稀釋曲線分析，從各樣本中細菌的稀釋度(rarefaction)曲線(圖5-B)可以看出，30條曲線均趨向平坦，2組樣本不同腸道區(qū)段樣本曲線均較為集中的聚類在一起，表明所測序數(shù)據(jù)量合理，大多數(shù)細菌類群包括在各樣本文庫中，能夠比較真實地反映樣本的微生物群落多樣性。

表4 各樣本的測序數(shù)據(jù)及OTUs、多樣性指數(shù)統(tǒng)計

圖5 各樣本序列長度分布圖(A)和稀釋度曲線(B)

2.3.2 肉雞腸道菌群組成分析

對照組和試驗組肉雞各腸道不同區(qū)段樣本均值的OTUs物種注釋結(jié)果如圖6所示，2組樣品中均存在著占很大比例的未能培養(yǎng)(uncultured)和未定義(unidentified)菌群，從門水平上看，2組樣品菌群中相對豐度最高的為厚壁菌門(Firmicutes)(24%～66%)、擬桿菌門(Bacteroidota)(12%～45%)和變形菌門(Proteobacteria)(1%～16%)；與對照組相比，試驗組各對應(yīng)腸道區(qū)段樣本菌群的厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門、變形菌門和放線菌門(Actinobacteriota)相對豐度降低。從屬的水平上看，2組樣品菌群的優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬(Lactobacillus)(12%～43%)、擬桿菌屬(Bacteroides)(13%～41%)和乳球菌屬(Lactococcus)(5%～21%)。與對照組相比，試驗組各對應(yīng)腸道區(qū)段樣本菌群的乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、另支菌屬(Alistipes)等有益菌屬相對豐度增加，擬桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、彎曲桿菌屬(Campylobacte)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)、大腸桿菌-志賀菌群(Escherichia-Shigella)、薩特氏菌屬(Sutterella)、密螺菌屬(Treponema)等病原菌屬相對豐度降低。

使用R語言vegan包，通過vegdist和hclust進行距離計算和聚類分析，對各樣本菌群相對豐度前20的屬進行聚類分析到Heatmap(圖7)，結(jié)果表明，各樣本菌群組成差異較大，其中相對豐度最高的是乳桿菌屬、擬桿菌屬、乳球菌屬和克里斯滕森菌科R-7群。與對照組相比，試驗組中乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群和另支菌屬等益生菌群的相對豐度增加，擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、彎曲桿菌屬和幽門螺桿菌屬(Helicobacter)等腸道病原菌相對豐度降低，所得結(jié)果與前述的各樣本OTUs物種注釋結(jié)果一致。

A：對照組十二指腸；B：對照組空腸；C：對照組回腸；D：對照組盲腸；E：對照組直腸；F：試驗組十二指腸；G：試驗組空腸；H：試驗組回腸；I：試驗組盲腸；J：試驗組直腸。下圖同。A: duodenum of control group; B: jejunum of control group; C: ileum of control group; D: cecum of control group; E: rectum of control group; F: duodenum of test group; G: jejunum of test group; H: ileum of test group; I: cecum of test group; J: rectum of test group. The same as below.

圖7 各樣本屬水平微生物菌群Heatmap分析

2.3.3 肉雞腸道各部位菌群差異性分析

采用R語言PCA統(tǒng)計分析和作圖，對照組和試驗組肉雞各腸道不同區(qū)段菌群的組成差異性PCA結(jié)果如圖8所示。同一腸道區(qū)段3個取樣樣本菌群能較好地聚類在一起，但2組間各對應(yīng)腸道區(qū)段樣本的菌群組成差異明顯，無法較好地聚類在一起，表明試驗組添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料飼喂后其腸道菌群的組成明顯改變。另外，2組樣品的十二指腸、空腸和回腸菌群組成均較為相近，可以較好地聚類在一起，但盲腸、直腸與它們的菌群組成差異較大，無法聚類在一起。

圖8 各樣本屬水平微生物菌群PCA

2組樣品各樣本LEFSe分析表明(圖9)，共富集了13個屬菌群，其中彎曲桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、薩特氏菌屬、罕見小球菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、厭氧螺菌屬和密螺菌屬腸道常見病原菌群在對照組腸道樣本中的相對豐度最高，而乳球菌屬、另支菌屬、弗尼雷拉菌屬(Fournierella)、乳桿菌屬和克里斯滕森菌科R-7群在試驗組中相對豐度最高，所得結(jié)果與前述結(jié)果基本一致。

3 討 論

近年來，菌酶協(xié)同發(fā)酵成為了生物飼料發(fā)酵技術(shù)研究的熱點，菌酶協(xié)同作用是微生物參與的生命活動過程和酶參與的生物化學(xué)過程的有機結(jié)合，在協(xié)同過程中涉及到多種基質(zhì)、菌種和酶，其機理極其復(fù)雜。研究已證實，飼糧中添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對畜禽的生長性能具有良好的促進作用[18-19]，但對畜禽肉品質(zhì)的影響及機理的研究報道較少。本研究表明，與對照組相比，添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料飼喂，肉雞肌肉的各項風味物質(zhì)含量、肉品質(zhì)指標均有明顯的增長或改善。推測原因一方面是復(fù)合微生物有益菌群如乳酸菌產(chǎn)生了乳酸、脂肪酸等代謝物[20]，由畜禽吸收并進一步沉積到肌肉中，促進畜禽肌肉中風味物質(zhì)的生成；另一方面，NSP的加入，飼料原料中的淀粉多糖得到了切割、分解，黏度降低，包裹的營養(yǎng)物質(zhì)被溶解釋放，促進了消化吸收[21]，有利于肌苷酸、?；撬岬纫恍┐x中間產(chǎn)物的風味物質(zhì)形成；最后，發(fā)酵飼料的添加降低了肌肉中的膽固醇類物質(zhì)含量，提高了不飽和脂肪酸的含量，改善肌肉營養(yǎng)成分，表明發(fā)酵飼料及其代謝產(chǎn)物可能可以直接或間接地參與畜禽機體內(nèi)的膽固醇、脂肪酸合成與代謝調(diào)控，進一步影響肉雞肌肉中脂肪酸的組成，從而影響肉品質(zhì)。

圖9 各樣本微生物菌群的LEFSe分析

轉(zhuǎn)錄組測序表明，壓力的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程和免疫反應(yīng)是試驗組肉雞整個腸道上調(diào)差異表達基因的GO功能富集的最多的類別。KEGG富集分析表明，上調(diào)差異表達基因被注釋到162條代謝通路中，其中與新陳代謝有關(guān)11個、與免疫相關(guān)的9個，這些結(jié)果表明，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料的添加對肉雞的氨基酸代謝、次級產(chǎn)物代謝及免疫功能產(chǎn)生了重要的影響。試驗組在脂肪細胞因子信號通路、嘧啶代謝、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝等代謝通路上調(diào)差異表達，有利于肉雞氨基酸、膽固醇、牛磺酸和不飽和脂肪酸等風味物質(zhì)的形成。試驗組添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料后可能激活肉雞體內(nèi)產(chǎn)生吞噬體[22]，進而通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、C型凝集素受體信號通路和細胞黏附分子信號通路進行信號傳遞[23]，刺激機體產(chǎn)生細胞因子[24]，并通過增強甲型流感、單純皰疹病毒1型感染等病毒代謝通路免疫反應(yīng)最終起到綜合免疫作用。

雞的腸道內(nèi)多種微生物共生在宿主體內(nèi)形成了一個復(fù)雜而動態(tài)的微生物群落，對宿主健康和生產(chǎn)性能具有重要的生理學(xué)意義，主要表現(xiàn)在免疫屏障、免疫系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)、宿主營養(yǎng)吸收和解毒方面的作用[25]。研究表明，畜禽飼養(yǎng)中添加益生菌發(fā)酵制劑，可以起到增加腸道有益菌數(shù)量、維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)、增強抵抗力、降低病原菌數(shù)量、改善其生長性能的功效[26-27]。本研究腸道各部位菌群的組成分析表明，肉雞腸道每1個區(qū)段都有自己獨特的菌群組成，從而發(fā)揮其不同的代謝功能，從菌群數(shù)量和種類上看，盲腸>直腸>十二指腸>回腸>空腸，其中十二指腸、回腸、空腸的菌群組成較為一致，但與盲腸、直腸的菌群組成差異較大。盲腸是肉雞中菌群數(shù)量和種類最高的腸道區(qū)段，而十二指腸由于pH低，加上胰腺和膽分泌物的抑制和稀釋作用，其菌群組成數(shù)量最少[28]。肉雞腸道各區(qū)段菌群組成從門水平上看，相對豐度最多的2個門是厚壁菌門和擬桿菌門，研究認為兩者豐度之比(F/B)是評價畜禽腸道菌群組成的重要指標，F(xiàn)/B增加，有利于提高厚壁菌門細菌獲取能量的能力，從而促進畜禽生長[29]。沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等變形菌門細菌在肉雞腸道內(nèi)定植會導(dǎo)致腸道感染引發(fā)腸道及腸道外疾病，是影響畜禽腸道健康的重要因素[30]。從屬水平上看，乳桿菌屬和乳球菌屬是肉雞腸道主要優(yōu)勢益生菌，其在肉雞腸道定植，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和抑菌因子，降低腸道pH，限制了病原菌增殖，具有預(yù)防感染和腹瀉的功效[31]。克里斯滕森菌科R-7群、另支菌屬能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)炎癥，對某些疾病有保護作用，對調(diào)節(jié)腸道健康、促進畜禽生長起到了一定的作用[32]。擬桿菌屬、腸球菌屬、彎曲桿菌屬、罕見小球菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、葡萄球菌屬、幽門螺桿菌屬、厭氧螺菌屬和密螺菌屬都是畜禽腸道中常見的病原菌屬，如彎曲桿菌屬為空腸中的主要研究對象，是“人畜共患病”的食源性病原菌之一，常引起血液炎癥，導(dǎo)致畜禽痙攣、疼痛和腹瀉[33]；葡萄球菌屬易引起肉雞壞死性腸炎[34]；密螺菌屬細菌易引起的豬血痢[35]等。本研究證實，添加益生菌發(fā)酵飼料，試驗組腸道各區(qū)段微生物菌群的相對豐度上升，但菌群的多樣性下降，推測原因可能是乳酸菌等益生菌的繁殖降低了腸道pH，抑制了一些腸道菌和病原菌的生長，增強了畜禽的免疫功能[36]，所得結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)論一致。試驗組各腸道不同區(qū)段的厚壁菌門相對豐度顯著增加，擬桿菌門相對豐度降低，乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、另支菌屬相對豐度增加，擬桿菌屬、腸球菌屬、彎曲桿菌屬等肉雞腸道常見病原菌屬相對豐度減少，有利于改善肉雞腸道健康，保持菌群穩(wěn)態(tài)，提高免疫功能，促進氨基酸、牛磺酸、不飽和脂肪酸等代謝物的形成，最終降低畜禽腸道疾病的發(fā)病率，促進肉雞生長，提高肉雞肌肉風味品質(zhì)的含量。

4 結(jié) 論

飼糧中添加5.0%的菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料可以提高肉雞胸肌、腿肌的總氨基酸、風味氨基酸、肌苷酸、不飽和脂肪酸等風味物質(zhì)的含量，在轉(zhuǎn)錄組水平上加強氨基酸、次級產(chǎn)物及免疫功能等代謝通路基因的上調(diào)差異表達，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、保持菌群穩(wěn)態(tài)，對病原菌免疫、調(diào)節(jié)肉雞腸道健康起到了一定的作用。