陳繼發(fā) 張佳鑫

(宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春 336000)

家禽腸道既是消化和吸收養(yǎng)分的重要器官，也是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的先天性免疫屏障[1]。維持正常的腸道屏障功能對提高家禽生產(chǎn)性能具有重要意義。研究表明，蒙脫石等霉菌毒素吸附劑(mycotoxin adsorbent,MA)能夠有效吸附霉菌毒素、致病菌及細(xì)菌毒素等，降低病原體對家禽腸道造成的損害，維護腸道健康[2-3]。植物精油(essential oil,EO)和有機酸(organic acid,OA)具有良好的防霉、抗菌、抑炎等功能，能夠改善家禽腸道健康[4-5]。飼糧受多種低水平[霉菌毒素含量在我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)限定范圍內(nèi)]霉菌毒素污染和有害菌誘發(fā)的腸道疾病是蛋雞養(yǎng)殖中較普遍存在的問題?；贛A、EO和OA的功效，推測MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物也許能有效緩解霉菌毒素、致病菌等對蛋雞腸道造成的損傷，維護腸道屏障功能。本課題組同期研究表明，飼糧中添加0.65 g/kg MA-OA復(fù)合物或0.70 g/kg MA-EO復(fù)合物有提高蛋雞產(chǎn)蛋率的趨勢，且顯著提高了蛋重[6]，推測可能與二者改善蛋雞腸道健康有關(guān)。因此，本試驗旨在研究在被多種低水平霉菌毒素污染的飼糧中添加MA-OA復(fù)合物或MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道屏障功能的影響，以期為二者在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用以及通過營養(yǎng)調(diào)控方式改善家禽腸道健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MA-OA復(fù)合物主要成分：MA(蒙脫石)含量為80%，OA(主要為甲酸、丙酸和丁酸)含量>10%；MA-EO復(fù)合物主要成分：MA(蒙脫石)含量為75%，EO(主要為丁香酚和肉桂醛)含量>4%。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

將270只健康的29周齡羅曼蛋雞隨機分為3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。Ⅰ組(對照組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅱ組、Ⅲ組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.65 g/kg MA-OA復(fù)合物、0.70 g/kg MA-EO復(fù)合物的試驗飼糧。預(yù)試期1周，正試期10周。參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)設(shè)計蛋雞基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平參見文獻[6]。蛋雞采用半開放式3層階梯式籠養(yǎng)，每日飼喂2次，自由飲水，雞舍光照時間為16 h。試驗期雞舍平均溫度、相對濕度分別為(26±3) ℃、(77±6)%。采集試驗第1天、第18天、第35天、第53天、第70天的飼糧樣品，經(jīng)檢測，飼糧中常見霉菌毒素的含量均未超過我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 1307—2017)的限定標(biāo)準(zhǔn)。基礎(chǔ)飼糧中霉菌毒素含量實測值參見文獻[6]。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后，各重復(fù)隨機抽取1只蛋雞，參照文獻[7-8]的方法采集回腸內(nèi)容物、腸黏膜和小腸腸段樣品?；啬c內(nèi)容物和腸黏膜樣品于-80 ℃保存，小腸腸段樣品浸入4%甲醛溶液中。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 回腸微生物相對數(shù)量

提取蛋雞回腸內(nèi)容物細(xì)菌DNA后，將所有DNA樣品的濃度稀釋至100 ng/μL。使用實時熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]進行PCR擴增，反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和引物序列參照文獻[9]。以總細(xì)菌為參比基因，采用2-ΔΔCt法計算目的細(xì)菌的相對數(shù)量[10]。

1.4.2 回腸黏膜基因表達

使用Trizol試劑提取蛋雞回腸黏膜總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，然后以其為模板使用實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，以上試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。用Primer Premier 5.0設(shè)計閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白-1(claudin-1)、閉合蛋白-5(claudin-5)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、黏蛋白-2(mucin-2，MUC-2)、黏蛋白-5ac(mucin-5ac，MUC-5ac)、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κBp65)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的引物，由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和引物序列參照文獻[11]。以β-肌動蛋白(β-actin)為參比基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達水平。

1.4.3 腸道形態(tài)

從甲醛固定液中取出腸段樣品，經(jīng)修塊、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和蘇木精-伊紅(HE)染色后，用中性樹膠封片，最后在倒置熒光顯微鏡(Olympus IX51，Olympus，日本)下觀察，測量絨毛高度、隱窩深度，并計算二者比值。

1.4.4 回腸刷狀緣酶活性

參照文獻[8]的方法制備10%的腸黏膜組織勻漿，離心后吸取上清液，測定堿性磷酸酶、蔗糖酶、麥芽糖酶和乳糖酶活性，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析，差異顯著者用Duncan氏法作多重比較。試驗結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸微生物相對數(shù)量的影響

由表1可知，各組間回腸雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌的相對數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅱ組、Ⅲ組產(chǎn)氣莢膜梭菌的相對數(shù)量分別顯著降低了55%、84%(P<0.05)，Ⅲ組沙門氏菌的相對數(shù)量顯著降低了64%(P<0.05)。Ⅲ組產(chǎn)氣莢膜梭菌的相對數(shù)量較Ⅱ組顯著降低了64%(P<0.05)。

2.2 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸黏膜基因表達的影響

由表2可知，各組間回腸黏膜claudin-1、ZO-1、MUC-2、MUC-5ac、TLR2、TLR4和TNF-αmRNA相對表達水平均無顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅱ組回腸黏膜claudin-5 mRNA相對表達水平顯著上調(diào)了83%(P<0.05)，MyD88和IL-1βmRNA相對表達水平分別顯著下調(diào)了48%、52%(P<0.05)；Ⅲ組MyD88、NF-κBp65和IL-1βmRNA相對表達水平分別顯著下調(diào)了25%、40%、37%(P<0.05)。Ⅲ組occludin mRNA相對表達水平較Ⅱ組顯著上調(diào)了59%(P<0.05)。

表1 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸微生物相對數(shù)量的影響

表2 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸黏膜基因表達的影響

2.3 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道形態(tài)的影響

由表3可知，各組間空腸和回腸絨毛高度無顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組空腸絨毛高度/隱窩深度值顯著提高了34.17%(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅲ組回腸絨毛高度/隱窩深度值分別顯著提高了34.06%、41.25%(P<0.05)，同時回腸隱窩深度有降低的趨勢(P=0.088)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組空腸隱窩深度顯著降低了35.72%(P<0.05)，空腸絨毛高度/隱窩深度值顯著提高了26.67%(P<0.05)。

2.4 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸刷狀緣酶活性的影響

由表4可知，各組間回腸麥芽糖酶和乳糖酶活性均無顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組回腸堿性磷酸酶活性顯著提高了84.29%(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅲ組回腸蔗糖酶活性分別顯著提高了86.10%、86.73%(P<0.05)。Ⅲ組回腸麥芽糖酶活性較Ⅱ組有提高的趨勢(P=0.073)。

3 討 論

3.1 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸微生物相對數(shù)量的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加MA-OA復(fù)合物或MA-EO復(fù)合物均降低了蛋雞回腸產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌相對數(shù)量。研究表明，蒙脫石、OA或EO能夠降低蛋雞腸道有害菌數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[9,12-13]，本試驗結(jié)果與前人的報道基本相符。本試驗中蛋雞的飼糧被多種霉菌毒素污染，霉菌毒素間存在互作效應(yīng)，幾種低劑量霉菌毒素協(xié)同作用后的毒性增加，且毒素在動物體內(nèi)不斷蓄積，會產(chǎn)生潛在危害[14-16]。同時，研究證實，低劑量霉菌毒素對家禽生產(chǎn)性能、機體免疫與抗氧化性能及腸道屏障功能等會產(chǎn)生負(fù)面影響[17-18]。資料表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素會影響動物腸道微生物的組成，降低微生物多樣性[15,19]。本試驗所用飼糧含有多種低劑量的霉菌毒素，其可能潛在影響蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，推測MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用也許與其減輕低劑量霉菌毒素造成的腸道菌群紊亂有關(guān)。腸道微生物會同宿主爭奪腸腔內(nèi)養(yǎng)分而降低飼料利用率，最終影響動物的生產(chǎn)性能。本課題組同期研究顯示MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物一定程度上改善了蛋雞產(chǎn)蛋性能[6]，推測蛋雞腸道有害菌數(shù)量的降低可能是MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物改善蛋雞產(chǎn)蛋性能的一個重要原因。

表3 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道形態(tài)的影響

表4 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸刷狀緣酶活性的影響

3.2 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸黏膜基因表達的影響

TLR4識別并特異性結(jié)合配體后，可通過MyD88依賴性通路激活NF-κB，使其移位進入細(xì)胞核并誘導(dǎo)促炎因子釋放，而促炎因子的過量表達會引發(fā)炎癥[20]。研究表明，霉菌毒素、致病菌能夠激活TLR4信號通路，誘導(dǎo)促炎因子過量表達，引起家禽腸道炎癥[16-17,21]。本試驗中，Ⅲ組蛋雞回腸黏膜NF-κBp65 mRNA相對表達水平較Ⅰ組顯著下調(diào)，Ⅱ組、Ⅲ組回腸黏膜MyD88、IL-1βmRNA相對表達水平較Ⅰ組顯著下調(diào)，且TLR4 mRNA相對表達水平也有一定下調(diào)，初步表明MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物可能影響TLR4/NF-κB信號通路，有利于抑制促炎因子表達，降低炎癥反應(yīng)，本試驗結(jié)果與Chen等[8]、Liu等[22]和Yang等[23]的研究結(jié)果相似。MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物是否能夠調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路還需分析通路中關(guān)鍵蛋白活性和炎癥因子蛋白表達的變化。

本試驗中，Ⅱ組回腸claudin-5 mRNA相對表達水平較Ⅰ組顯著上調(diào)，提示MA-OA復(fù)合物可能促進了腸道緊密連接蛋白的表達，有利于維護腸道物理屏障，這可能是由于MA-OA復(fù)合物能夠降低霉菌毒素、致病菌等病原體對腸上皮細(xì)胞造成的損傷；此外，其含有的蒙脫石可在腸道內(nèi)延展，形成連續(xù)的保護膜而保護腸道黏膜。研究表明，蒙脫石可以顯著提高蛋雞空腸occludin、claudin-1和claudin-5 mRNA相對表達水平[3,8]；OA能夠調(diào)節(jié)家禽腸道緊密連接蛋白的基因表達[24-25]。本試驗結(jié)果與以上報道基本相符。

3.3 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道形態(tài)的影響

絨毛高度、隱窩深度及二者比值是評估腸道結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)。本試驗中，Ⅱ組、Ⅲ組小腸絨毛高度/隱窩深度值較Ⅰ組顯著提高，回腸隱窩深度較Ⅰ組有降低的趨勢，說明添加MA-OA復(fù)合物或MA-EO復(fù)合物有利于維護蛋雞腸道結(jié)構(gòu)的完整性，本試驗結(jié)果與曾子悠等[5]、Wang等[12]和Yarmohammadi Barbarestani等[25]的報道基本相符。MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物改善腸道形態(tài)的機制可能與其能夠抑制腸道致病菌有關(guān)。致病菌及其產(chǎn)生的細(xì)菌毒素能夠打破腸道菌群平衡，誘發(fā)腸道炎癥，進而損害腸黏膜結(jié)構(gòu)，同時也不利于腸絨毛再生。本試驗中腸道形態(tài)的結(jié)果與腸道微生物相對數(shù)量、腸黏膜基因表達的結(jié)果基本可以相互佐證。此外，研究表明，低劑量霉菌毒素如黃曲霉毒素B1能夠誘導(dǎo)家禽腸道損傷，破壞腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)[17-18]。本試驗所用蛋雞飼糧被多種霉菌毒素污染，推測MA-OA復(fù)合物、MA-EO復(fù)合物可能緩解了飼糧中低劑量霉菌毒素對蛋雞腸道結(jié)構(gòu)造成的損害。

3.4 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞回腸刷狀緣酶活性的影響

小腸刷狀緣堿性磷酸酶和二糖酶的活性是評價腸上皮細(xì)胞成熟程度及腸道功能的重要指標(biāo)。本研究表明，飼糧中添加MA-OA復(fù)合物或MA-EO復(fù)合物均提高了蛋雞回腸蔗糖酶活性，添加MA-EO復(fù)合物還提高了回腸堿性磷酸酶活性。研究表明，香芹酚、蒙脫石或EO和OA的復(fù)合物可以提高蛋雞、肉雞腸黏膜二糖酶活性[18,26-27]。MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物提高腸道刷狀緣酶活性的可能機制如下：2種添加劑均含有蒙脫石，其晶層間二價銅離子(Cu2+)、二價鋅離子(Zn2+)、三價鐵離子(Fe3+)等在動物腸道中被置換出來，可能發(fā)揮激活相關(guān)酶的作用[28]；此外，完整的腸黏膜結(jié)構(gòu)可促進刷狀緣酶的分泌，MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物也可能通過降低腸道致病菌數(shù)量、改善腸黏膜形態(tài)而提高刷狀緣酶活性。本試驗中蛋雞回腸刷狀緣酶的活性與回腸微生物相對數(shù)量、腸道形態(tài)的結(jié)果基本可以相互佐證。健康的腸道是家禽充分發(fā)揮生產(chǎn)性能的重要前提。綜上可知，MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物均能夠改善蛋雞腸道健康，這可能是其在一定程度上提高蛋雞生產(chǎn)性能[6]的主要原因之一。

3.5 MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對蛋雞腸道黏膜屏障功能影響的比較

本試驗結(jié)果顯示，與Ⅱ組相比，Ⅲ組蛋雞回腸產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌相對數(shù)量和空腸隱窩深度顯著降低，回腸occludin mRNA相對表達水平和空腸絨毛高度/隱窩深度值顯著提高，回腸黏膜麥芽糖酶活性有提高的趨勢，從以上結(jié)果可以看出，MA-EO復(fù)合物在降低蛋雞腸道有害菌數(shù)量、促進緊密連接蛋白表達以及改善腸道形態(tài)方面的作用優(yōu)于MA-OA復(fù)合物，說明飼糧中添加MA-EO復(fù)合物對改善蛋雞腸道健康的效果相對更好。研究表明，EO可以降解細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞有害菌細(xì)胞質(zhì)膜，直接殺滅細(xì)菌[29]；另外，EO還可以干擾細(xì)菌群體感應(yīng)，抑制有害菌產(chǎn)生毒力因子[30]。據(jù)報道，OA主要通過電離出氫離子降低腸道pH及未解離的OA分子穿透細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)揮抑菌作用[4,31]。據(jù)此分析，與OA相比，EO或許能夠更有效、快速地控制腸道有害菌，降低其毒力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，本試驗所用MA可以顯著降低蛋雞腸道沙門氏菌、大腸桿菌等有害菌數(shù)量[9]，有效“綁定”脂多糖[8]，作者分析EO與MA聯(lián)用能夠發(fā)揮出更強的抑菌殺菌作用，進而減少有害菌對腸道造成的損傷，維護蛋雞腸道屏障功能。

4 結(jié) 論

飼糧添加MA-OA復(fù)合物或MA-EO復(fù)合物均能夠降低蛋雞回腸有害菌數(shù)量，下調(diào)回腸黏膜促炎因子基因表達，提高回腸刷狀緣酶活性，改善腸道黏膜形態(tài)。由此可見，MA-OA復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物能夠改善蛋雞腸道屏障功能，可作為動物腸道健康調(diào)節(jié)劑。