汪以真

(浙江大學動物科學學院，動物分子營養(yǎng)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部(華東)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，綠色飼料與健康養(yǎng)殖國家工程研究中心，浙江省飼料與動物營養(yǎng)重點實驗室，杭州 310058)

脂肪組織是動物體內(nèi)最主要的儲能器官，也是重要的代謝和分泌器官，可以通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌信號調(diào)節(jié)機體糖、脂代謝。脂肪組織發(fā)育和沉積影響動物的生長、生產(chǎn)、繁殖和健康，其過度沉積直接影響畜禽生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。同時，脂肪的過度沉積也與人類肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，如何調(diào)控動物脂肪沉積與脂質(zhì)代謝對畜禽健康高效養(yǎng)殖和優(yōu)質(zhì)畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)以及人類健康都具有重要的意義。

脂肪組織的發(fā)育和沉積主要包括脂肪細胞數(shù)目增加和體積增大。成熟脂肪細胞是由間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化而來，MSCs經(jīng)過定向分化成脂肪祖細胞，脂肪祖細胞增殖后形成前體脂肪細胞，前體脂肪細胞經(jīng)過增殖、分化聚酯形成成熟脂肪細胞。脂肪組織發(fā)育和脂肪沉積過程是一個復雜的過程，受到遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境和飼養(yǎng)方式等多種因素影響，近期許多研究表明，表觀遺傳學修飾在調(diào)控動物脂肪組織發(fā)育和脂肪沉積過程中發(fā)揮了重要的作用，其中，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修飾是表觀遺傳學修飾領(lǐng)域中的研究熱點之一。本實驗室以及國內(nèi)外學者研究表明，mRNA m6A修飾直接參與調(diào)控脂肪前體細胞分化聚酯和動物糖、脂代謝。因此，本文主要從脂肪組織種類、mRNA m6A修飾生物學功能、mRNA m6A修飾對脂肪沉積的影響及作用機制與營養(yǎng)調(diào)控等方面綜述了mRNA m6A修飾調(diào)控脂肪沉積的相關(guān)研究進展。

1 動物脂肪組織組成及其功能

脂肪組織由成熟脂肪細胞、前體脂肪細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞以及微血管等組成，其中成熟脂肪細胞是脂肪組織中的主要細胞類型[1]。根據(jù)成熟脂肪細胞顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能差異，動物脂肪可分為白色脂肪(white adipose tissue，WAT)、棕色脂肪(brown adipose tissue，BAT)、米色脂肪(beige/brite fat)等[2]。WAT主要位于腹腔器官周圍和皮下等，如豬的背膘、腸系膜脂肪和腎周脂等脂肪組織都屬于WAT，具有保持體溫、機械保護、儲能與代謝等功能[2]。WAT主要由成熟的WAT細胞構(gòu)成，細胞內(nèi)含有大量的脂質(zhì)三?；视?triacylglycerols，TAGs)和少量的線粒體。WAT是重要的儲能器官，過度沉積影響飼料轉(zhuǎn)化效率和動物生產(chǎn)性能等[2]。BAT主要分布在肩胛部、腋窩部、頸后部、鎖骨上部等[3]。嚙齒動物及小型哺乳動物體內(nèi)含有更豐富的BAT，豬的BAT在進化過程中消失，人類BAT在嬰幼兒期較為發(fā)達，但隨著年齡的增長逐漸減少。BAT中主要細胞類型是成熟的BAT細胞，BAT細胞中含有多個小脂滴、較多的線粒體，在產(chǎn)熱、調(diào)節(jié)體溫及機體糖、脂代謝等方面發(fā)揮重要作用。beige細胞是一種特殊類型，存在于WAT中卻類似于BAT的一類脂肪細胞，含有多個小的脂滴，在體溫穩(wěn)態(tài)、能量穩(wěn)態(tài)和體重控制中起關(guān)鍵作用[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，中國地方豬如藏豬、閩豬具有良好的抗寒特性，可通過beige細胞中的解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)3表達來產(chǎn)熱，進行體溫調(diào)節(jié)；急性冷刺激可誘導仔豬WAT棕色化，也可通過beige細胞激活劑激活WAT棕色化來維持仔豬體溫，降低生豬養(yǎng)殖過程中仔豬因冷應激導致的死亡[5-6]。

根據(jù)脂肪沉積部位的不同，脂肪組織主要分為皮下脂肪組織(subcutaneous fatty tissue，SAT)、內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue，VAT)和肌肉脂肪等[7-8]。SAT主要分布在股臀部、背部及前腹部，具有保持體溫和參與脂質(zhì)代謝等功能。VAT主要分布在腹腔內(nèi)，沉積在臟器周圍，具有穩(wěn)定、緩沖和保護內(nèi)臟器官的功能。SAT和VAT的過度沉積，影響胴體瘦肉率，降低了飼料利用效率及生產(chǎn)效益。肌肉內(nèi)的脂肪沉積分布在骨骼肌中，包括肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)和肌間脂肪，與肉品質(zhì)密切相關(guān)。其中IMF含量直接影響肉的脂肪酸組成和風味、多汁性、嫩度、色澤等，影響肉的營養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)，是提高肉品質(zhì)的生物學基礎(chǔ)之一[9-10]。因此，如何精準調(diào)控不同部分脂肪沉積，對改善畜禽肉品質(zhì)和保障畜禽健康養(yǎng)殖具有重要意義。

2 mRNA m6A修飾及其生物學功能

早在20世紀70年代，科研人員發(fā)現(xiàn)高等真核生物mRNA和lncRNA中存在m6A表觀修飾[11]。隨后研究表明，m6A修飾與mRNA穩(wěn)定性密切相關(guān)[12]。1997年，Bokar等[13]首次發(fā)現(xiàn)了m6A修飾甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3，METTL3)，2011年，又發(fā)現(xiàn)了m6A修飾去甲基化酶-脂肪含量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)，表明m6A是一種動態(tài)可逆的RNA修飾[14]。2012年，Dominissini等[15]利用甲基化RNA免疫共沉淀高通量測序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq)等技術(shù)首次繪制了人類和小鼠的m6A修飾圖譜。目前發(fā)現(xiàn)的RNA修飾一共有100多種，其中，m6A修飾是哺乳動物中分布最廣泛、含量最豐富的RNA修飾[16]。mRNA m6A修飾發(fā)揮作用與甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白密切相關(guān)。mRNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是一個多蛋白組成的復合物，主要參與催化m6A修飾。METTL3是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的核心組分，定位于細胞核內(nèi)[17]，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性[18]，可對特定的轉(zhuǎn)錄本進行m6A修飾。m6A修飾甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)是另一個關(guān)鍵m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，可與METTL3形成穩(wěn)定的異二聚體，提高METTL3催化m6A修飾效率[19]。WT1相關(guān)蛋白(WT1 associated protein，WTAP)參與m6A修飾反應底物募集和METTL3/14定位，進而與METTL3/14結(jié)合[20]。病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)化酶(Vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA)偏好介導mRNA 3’-UTR和近終止子區(qū)域的修飾[21]，CCCH型鋅指蛋白13(CCCH-type zinc finger protein 13，ZC3H13)有助于甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的核定位[22]，RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RNA binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)可結(jié)合U富集區(qū)域，并促進mRNA和X失活特異轉(zhuǎn)錄物(X-inactive specific transcript，XIST)m6A修飾[23]。mRNA m6A去甲基化酶主要參與催化m6A修飾去甲基化，在目前已知的2個m6A去甲基化酶中，F(xiàn)TO和ALKB H5同系物(ALKB homolog H5，ALKBH5)均屬于ALKB蛋白家族的一員，具有典型的依賴Fe2+和α-酮戊二酸的雙加氧酶特性。FTO基因敲除可導致小鼠出生后致死率增加及生長遲緩[24]。而ALKBH5定位于組織的細胞核內(nèi)核小斑，參與mRNA出核等功能，在睪丸中表達較高，參與調(diào)控小鼠的精子發(fā)生過程[25]。mRNA m6A結(jié)合蛋白參與mRNA穩(wěn)定性、可變剪接、出核以及翻譯等過程[26-27]。目前已知的m6A結(jié)合蛋白主要是YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族(YTH domain protein family，YTHDC)、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP)和異質(zhì)性胞核核糖核蛋白蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP)。YTHDC1和HNRNP蛋白定位于細胞核，YTHDC1通過與核轉(zhuǎn)運受體相互作用，促進m6A修飾mRNA出核[28]，而HNRNP蛋白可以調(diào)控mRNA的選擇性剪切和結(jié)構(gòu)改變[29]。YTHDF1/2/3、YTHDC2和IGF2BP家族蛋白定位于細胞質(zhì)。其中，YTHDF1通過與翻譯起始因子和核糖體相互作用來促進m6A修飾mRNA的翻譯[26]，YTHDF2通過招募RNA降解因子促進m6A修飾mRNA的降解[30]，YTHDF3能夠分別協(xié)助YTHDF1/2調(diào)控m6A修飾mRNA的翻譯和降解[31]。YTHDC2參與m6A修飾mRNA的降解、翻譯和可變剪接[32]，而IGF2BP可以增強m6A修飾mRNA的穩(wěn)定性[33]。

mRNA m6A修飾生物學功能。近期研究表明，mRNA m6A修飾對于基因表達調(diào)控和細胞命運決定具有重要功能，并在多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，mRNA m6A修飾參與調(diào)控胚胎干細胞的自我更新及分化能力[34-36]。METTL3通過促進多種癌基因的翻譯誘導癌癥發(fā)生[37-39]，ALKBH5能促進乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的增殖和分化[40]，F(xiàn)TO在急性白血病中的致癌功能也被證實[41]，mRNA m6A修飾可通過控制癌癥相關(guān)基因的表達調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生。mRNA m6A在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量比其他部位更高[42]，F(xiàn)TO在成體神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSC)和神經(jīng)元中高度表達，F(xiàn)TO缺失不僅會降低NSC的增殖和神經(jīng)元分化，還會導致大腦體積和體重下降，進而引發(fā)學習和記憶受損[43]。mRNA m6A修飾參與卵母細胞成熟和精子發(fā)生[44]，閱讀器蛋白YTHDC2缺乏會導致小鼠睪丸和卵巢變小[32]。

mRNA m6A修飾與脂肪沉積調(diào)控密切相關(guān)。FTO作為影響肥胖的候選基因，過表達FTO可以顯著促進脂肪沉積[45]。為了進一步揭示FTO與脂肪沉積的關(guān)系，2014年，Zhao等[46]利用小鼠3T3-L1脂肪細胞細胞系，首次揭示了m6A與脂肪細胞分化的關(guān)系，結(jié)果提示mRNA m6A修飾與成脂分化呈負相關(guān)。2015年，本實驗室在豬前體脂肪細胞中研究發(fā)現(xiàn)，敲低FTO顯著升高mRNA m6A水平、降低前體脂肪細胞分化聚酯；過表達FTO顯著降低mRNA m6A水平、促進細胞脂肪沉積；利用甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸和甲基供體甜菜堿分別處理豬前體脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)提高m6A水平可降低脂肪沉積，而降低m6A水平可促進脂肪沉積，證實了m6A在豬脂肪細胞分化聚酯的負調(diào)控作用[47]。為了進一步探究mRNA m6A修飾與豬脂肪沉積的作用，本實驗室以肉脂型金華豬和瘦肉型長白豬為研究模型，發(fā)現(xiàn)金華豬脂肪組織和肌肉組織中的mRNA m6A水平均顯著低于長白豬，進一步通過MeRIP-Seq技術(shù)對豬脂肪組織和肌肉組織進行了全轉(zhuǎn)錄組水平的mRNA m6A分析，鑒定到了一批與豬皮下脂肪沉積密切相關(guān)的m6A修飾基因，如含patatin樣磷脂酶域蛋白2(patatin like phospholipase domain protein 2，PNPLA2)和UCP2等[48]，以及與豬肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)的m6A修飾基因，如線粒體載體2(mitochondrial carrier 2，MTCH2)等[49]。隨后，本實驗室開展了一系列研究，進一步證實了m6A對動物脂肪沉積的調(diào)控作用。Yao等[50]研究發(fā)現(xiàn)，在豬間充質(zhì)干細胞(pig mesenchymal stem cell，pBMSC)中，干擾METTL3可顯著降低m6A水平，促進pBMSC向脂肪細胞分化，而過表達METTL3可升高m6A修飾水平進而抑制pBMSC成脂分化。Wu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO以m6A依賴的方式可促進豬前體脂肪細胞成脂分化早期克隆增殖，而且可以促進小鼠3T3-L1和豬前體脂肪細胞的自噬從而促進脂肪生成[52]。Liu等[53]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白217(zinc finger protein 217，ZFP217)可通過抑制METTL3表達以降低m6A水平進而促進前體脂肪細胞成脂分化。同時，mRNA m6A與能量代謝及肥胖相關(guān)疾病發(fā)生也密切相關(guān)。BAT組織特異性敲除METTL3通過減少乙酰化PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(PR domain-containing protein 16，PRDM16)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)以及UCP1轉(zhuǎn)錄上的m6A修飾水平，減少BAT產(chǎn)熱，促進高脂誘導的肥胖發(fā)生[54]。脂肪組織特異性敲除FTO可升高m6A水平，促進WAT組織棕色化，增加能量消耗以抵抗高脂飲食誘導的肥胖發(fā)生[55]。巨噬細胞中特異性敲除METTL3可以改善炎癥和代謝穩(wěn)態(tài)，以防止飲食誘導的非酒精性脂肪肝和肥胖癥的發(fā)展[56]。與正常人相比，Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)患者血液中的m6A水平較低，而FTO、METTL3、METTL14、WTAPmRNA表達水平較高[57]。De Jesus等[58]通過MeRIP-Seq比較糖尿病患者和健康人群胰島樣品中的m6A甲基化圖譜、利用體外EndoC-βH1 β細胞模型以及小鼠β細胞METTL14敲除動物模型進行驗證，揭示了m6A在胰島中β細胞的細胞周期、胰島素分泌等生物學功能中的調(diào)控作用。

3 mRNA m6A修飾調(diào)控多能干細胞命運決定及其機制

多能干細胞(pluripotent stem cells，PSC)是一類具有自我更新、自我復制能力的多潛能分化干細胞，在一定條件下，PSC具有分化出多種細胞組織的潛能，也具有分化成脂肪細胞的能力。Takahashi等[59]于2006年研究發(fā)現(xiàn)，成熟體細胞可通過外源導入4個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子將其重編程為類似胚胎干細胞的一種細胞類型，被稱為誘導性多功能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。iPSC具有胚胎干細胞的再生特性，已成為了人類醫(yī)學研究的寶貴資源。m6A作為一種廣泛存在RNA甲基化修飾，在調(diào)節(jié)iPSC的發(fā)育和細胞命運轉(zhuǎn)變方面起重要作用[60]。m6A通過microRNA的調(diào)節(jié)進而促進小鼠胚胎成纖維細胞的自我更新[61]。Wen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ZC3H13能將m6A調(diào)節(jié)復合物錨定在細胞核中，通過促進m6A甲基化來提高胚胎干細胞的多能性。Wu等[62]近期也報道了m6A通過靶向細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(SOCS3)/Janus激酶2(JAK2)信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)途徑增加豬iPSC的多能性；進一步通過機制解析表明，METTL3的缺失了JAK2和SOCS3 mRNA的m6A水平，從而導致YTHDF1介導的JAK2翻譯減弱，最后抑制YTHDF2依賴的SOCS3 mRNA降解；此外，JAK2和SOCS3蛋白水平的變化共同抑制JAK2/STAT3信號傳導和下游靶點克魯珀爾樣因子4(Kruppel like factor 4，KLF4)和SRY-box轉(zhuǎn)錄因子2(SRY-box transcription factor 2，SOX2)的表達(iPSC多能性關(guān)鍵基因)，進而阻礙豬iPSC的自我更新和分化。綜上所述，mRNA m6A修飾是維持iPSC多能性所必需因素之一。然而，也有研究表明，m6A修飾不是維持多能性所必需的，而是胚胎干細胞向分化譜系的細胞命運轉(zhuǎn)變所必需的[36]。METTL3敲除導致的m6A缺失通過維持多能性因子SOX2等的表達，增強了細胞的自我更新并阻礙其分化。ZFP217是一種保守的轉(zhuǎn)錄因子，通過將METTL3隔離并抑制m6A甲基化來維持胚胎干細胞的自我更新，而ZFP217的缺失能增加多能調(diào)節(jié)因子中的m6A水平，并促進了它們的降解[63]。產(chǎn)生這些矛盾的原因可能是，m6A調(diào)節(jié)iPSC多能性與其細胞狀態(tài)有關(guān)[64]。具體而言，胚胎干細胞處于“幼稚”狀態(tài)，而小鼠外胚層干細胞來自植入后外胚層，其體內(nèi)分化能力有限，并為分化做好準備[65]。在初始狀態(tài)胚胎干細胞中METTL3的缺失導致多能性增強，而在啟動狀態(tài)的胚胎干細胞中METTL3的敲除會導致分化的加速。以上研究表明，m6A修飾參與iPSC的多能性和分化命運調(diào)控，其生物學功能依賴于iPSC的細胞類型及其細胞狀態(tài)。

在常規(guī)脂肪細胞分化培養(yǎng)基中，大多數(shù)iPSC均能正常表達脂肪細胞標志基因脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4)，但其成脂分化能力較弱；當添加維甲酸能激活脂肪生成關(guān)鍵基因如PPARγ、PPARδ以及CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein beta，C/EBPβ)等，誘導iPSC向脂肪祖細胞的分化[66]。在向脂肪細胞誘導分化過程中，iPSC同樣具有較弱的自發(fā)產(chǎn)生BAT/beige細胞能力，如何特異性分化成產(chǎn)熱脂肪細胞成為了一個新的亟待解決的科學問題。Wang等[67]首次報道了METTL3和METTL14的缺失降低m6A水平進而促進了小鼠胚胎干細胞的分化。發(fā)育相關(guān)基因的m6A修飾阻斷RNA穩(wěn)定蛋白Hu抗原R(HuR)與其的結(jié)合，從而維持多能性；而HuR作為RNA代謝的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，具有負調(diào)控脂肪沉積的功能，表明了m6A修飾可能具有調(diào)控PSC向脂肪細胞分化的能力[68]。

4 mRNA m6A修飾調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響及機制

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類廣泛參與組織損傷修復、免疫重塑等生物學功能的基質(zhì)細胞，具有多向分化潛能，可以分化為其他中胚層組織，如骨骼肌[69]、肌腱[70]、平滑肌[69]和內(nèi)皮[71]。研究結(jié)果表明，表觀遺傳修飾對于BMSCs細胞命運決定和維持平衡至關(guān)重要[72]。mRNA m6A修飾作為mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾，已被證實廣泛參與BMSCs的成脂分化[73]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs中METTL3的缺失通過破壞甲狀旁腺激素(PTH)/甲狀旁腺激素受體1(PTH1R)信號軸，促進成脂分化，抑制成骨分化潛能[35]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導的m6A甲基化修飾作用于PTH1R，促進其翻譯和蛋白質(zhì)合成；BMSCs中條件敲除METTL3會增加骨髓脂肪。本實驗室近期研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導的m6A甲基化抑制了豬BMSCs向前體脂肪細胞分化[50]。具體機制是，敲除METTL3會降低JAK1 mRNA的m6A水平，緩解YTHDF2依賴的JAK1 mRNA降解；JAK1蛋白豐度的增加激活了脂肪細胞信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)磷酸化，促進了C/EBPβ的轉(zhuǎn)錄和表達，最終導致成脂因子表達上調(diào)和脂肪形成促進BMSCs分化為脂肪細胞[50]。相反，生長分化因子11(GDF11)-FTO-PPARγ軸促使小鼠MBSCs的命運向脂肪細胞轉(zhuǎn)移，并緩解骨質(zhì)疏松癥期間的骨形成[74]。FTO抑制PPARγ基因mRNA m6A修飾，上調(diào)PPARγ基因的表達，促進成脂分化。在BMSCs成脂分化過程中，ALKBH5逐漸降低[75]，ALKBH5可以介導的TRAF4 mRNA去甲基化，進而增加TRAF4 mRNA的表達；TRAF4又與丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)結(jié)合以激活PKM2的激酶活性，激活β-連環(huán)蛋白信號，抑制BMSCs分化聚酯和脂肪沉積。此外，microRNA-149-3p通過靶向FTO直接調(diào)節(jié)BMSCs的分化聚酯和脂肪沉積[76]。綜上所述，mRNA m6A修飾在BMSCs定向分化為脂肪細胞過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

5 mRNA m6A修飾對前體脂肪細胞分化聚酯的影響及其機制

前體脂肪細胞分化主要經(jīng)歷3個階段，分別是早期階段、有絲分裂后中間階段和終末階段。前體脂肪細胞分化的實質(zhì)是一系列標志基因時序表達及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，每條網(wǎng)絡(luò)都包含多種轉(zhuǎn)錄因子，其中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子主要包括C/EBPα、C/EBPβ和PPARγ等。當小鼠缺失C/EBPα，脂肪細胞沒有脂質(zhì)沉積，小鼠出生后不久因低血糖而死亡[77]。PPARγ激活會促進脂質(zhì)的儲存、分配以及代謝等一系列作用提高嚙齒類動物和人類的胰島素敏感性[78]。

5.1 mRNA m6A修飾通過調(diào)控細胞周期影響前體脂肪細胞分化聚酯

有絲分裂克隆擴增(mitotic clonal expansion，MCE)發(fā)生在脂肪形成的早期，是脂肪細胞分化的前提條件[79]。在MCE過程中，生長受阻的前體脂肪細胞和小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)同步重新進入細胞周期，進行兩輪增殖。Merkestein等[80]報道，F(xiàn)TO通過調(diào)節(jié)MCE促進脂肪形成。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過m6A-YTHDF2依賴機制調(diào)控3T3-L1細胞的MCE。FTO的下調(diào)提高了細胞周期的2個關(guān)鍵調(diào)控因子——細胞周期蛋白A2(cyclin A2，CCNA2)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)的mRNA m6A修飾水平；隨后，YTHDF2介導m6A修飾的CCNA2和CDK2 mRNA的降解，導致異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松和胰島素(isobutyl methyl xanthine, dexamethasone and insulin，MDI)誘導的3T3L1細胞進入G2期的延遲，阻斷細胞周期進程，從而抑制脂肪形成；該結(jié)果表明，F(xiàn)TO介導的m6A在脂肪形成的早期階段起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[81]。此外，其他研究也表明，METTL3、METTL14和WTAP通過促進3T-L1細胞的MCE中的細胞周期轉(zhuǎn)變來正向控制脂肪生成[82]。敲除WTAP會抑制CCNA2表達上調(diào)，并在脂肪細胞分化的MCE期間阻止細胞周期轉(zhuǎn)換。本實驗室研究也顯示，ZFP217耗竭促進了METTL3的表達，上調(diào)細胞周期蛋白1(cyclin D1，CCND1) mRNA m6A的修飾水平，YTHDF2識別并降解甲基化的CCND1 mRNA，下調(diào)CCND1并抑制MCE，從而降低脂肪生成[53]。

5.2 mRNA m6A修飾通過調(diào)控成脂信號通路影響前體脂肪細胞聚酯

m6A及其修飾蛋白在前體脂肪細胞分化中的關(guān)鍵作用。Zhao等[46]研究發(fā)現(xiàn)，mRNA m6A修飾通過介導mRNA選擇性剪接來調(diào)節(jié)3T3-L1細胞的脂肪形成。在3T3-L1細胞前體脂肪細胞中，F(xiàn)TO位于細胞核和細胞質(zhì)中，脂肪細胞分化抑制了FTO的表達，而脂肪細胞分化過程中m6A修飾水平增加[83]。在脂肪細胞分化過程中，F(xiàn)TO通過抑制剪接位點附近的m6A水平，促進脂肪分化基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1T1)的外顯子跳躍性剪切并最終影響脂肪分化。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，在豬原代前體脂肪細胞中FTO和METTL3介導的m6A甲基化可以抑制脂肪生成[47]。同樣，另一項研究證明，F(xiàn)TO的m6A去甲基化酶活性是3T3-L1細胞成脂所必需的[84]。本實驗室也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO介導的m6A去甲基化通過JAK2-STAT3-C/EBPβ促進了豬前體脂肪細胞在早期成脂進程中的分化[51]。綜上所述，這些研究表明，mRNA m6A修飾與脂肪細胞分化聚酯呈負相關(guān)。

此外，本實驗室近期研究發(fā)現(xiàn)，m6A還可通過調(diào)控自噬通路調(diào)控3T3-L1細胞和豬原代前體脂肪細胞的分化，敲除FTO會增加了自噬的兩大調(diào)控因子自噬相關(guān)5(autophagy related 5，ATG5)和自噬相關(guān)7(autophagy related 7，ATG7)mRNA的m6A修飾水平；YTHDF2特異性靶向m6A修飾的ATG5和ATG7 mRNA，促進其mRNA降解，導致ATG5和ATG7蛋白表達降低，自噬小體形成減弱，從而抑制自噬和脂肪形成[52]。序列相似性家族134B(family with sequence similarity 134 member B，F(xiàn)AM134B)基因mRNA m6A修飾通過YTHDF2依賴的方式促進其蛋白豐度，促進豬前體脂肪細胞的分化[85]。除了m6A修飾相關(guān)的調(diào)控因子外，其他蛋白也參與了m6A介導的脂肪形成。例如，ZFP217以m6A依賴的方式促進成脂分化，ZFP217轉(zhuǎn)錄激活FTO基因表達并以m6A-YTHDF2依賴的方式來協(xié)調(diào)mRNA m6A修飾[86]。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)通過抑制FTO介導的m6A去甲基化負向調(diào)控小鼠成肌細胞成脂分化[87]。

6 mRNA m6A修飾與脂肪沉積的營養(yǎng)調(diào)控

6.1 甲基供體影響mRNA m6A修飾調(diào)控動物脂肪沉積

甜菜堿(betaine)，又名三甲基甘氨酸，是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的天然化合物。Scheibler在1869年首次從甜菜中分離出甜菜堿，它由甘氨酸和3個甲基組成，是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的天然化合物[88-89]。除了可以從食物中獲取補充外，動物機體本身也可以通過氧化膽堿分解代謝產(chǎn)生甜菜堿[90]。甜菜堿作為機體內(nèi)一種重要的代謝產(chǎn)物，具有促進畜禽生長性能、促進蛋白質(zhì)沉積、降低機體脂肪含量等多種功能，可有效減少機體脂肪積累和改善胰島素抵抗、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和肝脂肪變性等[91-94]。

研究發(fā)現(xiàn)，豬飼糧中添加0.125%甜菜堿，能顯著降低育肥豬的平均背膘厚度和血清甘油三酯含量[95]，可以促進脂肪酸的β氧化，加速脂肪分解，降低動物體脂含量及體脂重分配[95]。本實驗室早期研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加不同濃度的甜菜堿，可以有效降低豬體脂率，改善機體脂質(zhì)代謝，同時提高眼肌面積與日增重[96-97]。飼糧中添加甜菜堿還能顯著降低育肥豬血清中膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量，從而調(diào)節(jié)育肥豬脂肪酸代謝[98]。上述研究說明，飼糧添加甜菜堿可以有效提高豬的機體能量代謝，減少脂肪沉積。

近年來，不同實驗室針對甜菜堿調(diào)控動物脂肪沉積與脂質(zhì)代謝的機制開展了大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可以通過上調(diào)成纖維細胞生長因21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)來改善小鼠脂肪酸氧化并減少肝臟脂肪沉積[94]。甜菜堿作為蛋氨酸同型半胱氨酸循環(huán)的有效甲基供體，可以提高甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(betaine-homocysteine methyltransferase，BHMT)的表達和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)合成，激活AMPK信號通路，進而抑制脂肪沉積[98]，同時提高的SAM含量可以促進肉堿的合成[99-101]，提高肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)表達，增加了脂肪酸轉(zhuǎn)運，從而調(diào)控肌內(nèi)脂肪含量，改善肉品質(zhì)[102]。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1敲除小鼠飼糧添加甜菜堿可以有效激活動物脂肪組織中AMPK相關(guān)信號通路，提高線粒體生成基因和脂肪β-氧化相關(guān)基因表達，同時甜菜堿還降低了FTO表達并提高脂肪組織中的mRNA m6A修飾水平，從而抑制脂肪沉積[103]。甜菜堿可以通過細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)-PPARγ信號通路調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的脂質(zhì)代謝，促進骨骼肌細胞的脂質(zhì)積累[104]。此外，甜菜堿還可以通過下調(diào)小鼠肝臟中FTO的表達，增強高脂飲食動物肝臟脂質(zhì)輸出和脂肪酸氧化，從而抑制肝臟脂肪沉積，改善機體胰島素抵抗[93,105]。以上研究表明，甜菜堿可以通過影響動物表觀遺傳修飾及能量代謝途徑，從而有效減少動物脂肪沉積，改善脂質(zhì)代謝。甜菜堿通過RNA甲基化表觀遺傳調(diào)控動物脂肪沉積與能量代謝的作用已得到證實，這對甜菜堿在畜禽生產(chǎn)中的應用具有重要意義。

此外，甲基供體還包括膽堿、蛋氨酸和葉酸等，作為DNA、相關(guān)蛋白和RNA甲基化的主要底物，這些甲基供體通過表觀遺傳修飾在宿主脂肪沉積和基因表達方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用[106]。補充或限制甲基供體是一種有效的營養(yǎng)干預措施，如補充膽堿可以減少嚙齒動物[107]和雞[108]等的體脂沉積，在人類的臨床數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)高血清膽堿含量與低體脂呈正相關(guān)性[109]，研究表明，膽堿對脂代謝的作用部分依賴其對機體甲基化的調(diào)控[91]。限制蛋氨酸攝入量具有改善胰島素敏感性、恢復機體節(jié)律基因，從而減少脂肪沉積的功能[110]。研究顯示，蛋氨酸可以通過增加SAM甲基轉(zhuǎn)移途徑或上調(diào)METTL3蛋白表達來增加m6A修飾，進而調(diào)控T細胞功能等免疫進程，補充蛋氨酸能增加機體m6A修飾，這可能影響肝臟、肌肉和乳腺中的脂質(zhì)合成過程[111-112]。但是，關(guān)于蛋氨酸等其他甲基供體能否直接通過m6A修飾來調(diào)控機體脂肪沉積有待進一步深入研究。

6.2 植物提取物影響mRNA m6A修飾調(diào)控動物脂肪沉積

姜黃素(curcumin)是一種黃色多酚類物質(zhì)，具有廣泛的生物學功能，如抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤等[113-114]。然而，姜黃素作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中的應用還處于起步階段，且在仔豬上的研究相對較少。Lu等[115]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加200 mg/kg的姜黃素可以提高仔豬的生長性能和飼料利用率，緩解仔豬因斷奶造成的肝臟氧化應激，并改善血脂代謝。同時，Lu等[115]進一步通過向斷奶仔豬腹腔注射脂多糖(LPS)建立免疫應激模型后發(fā)現(xiàn)，向免疫應激仔豬飼糧中添加200 mg/kg的姜黃素可以改善仔豬的生長性能，降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、硬脂酰輔酶A去飽和酶的基因表達，從而降低仔豬血清膽固醇和肝臟甘油三酯含量。值得關(guān)注的是，飼糧中添加姜黃素后還顯著提高了免疫應激仔豬肝臟的整體m6A水平。由于肝臟是仔豬生長發(fā)育過程中營養(yǎng)物質(zhì)代謝和合成的重要器官，m6A修飾又與豬肝臟的分化和發(fā)育緊密聯(lián)系，因此姜黃素是否以及如何通過mRNA m6A修飾調(diào)控仔豬生長發(fā)育過程中肝臟的脂質(zhì)代謝進而調(diào)控整體的生產(chǎn)性能有待研究[116]。而在脂肪組織中，姜黃素則被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制去甲基化酶ALKBH5的表達，提高脂肪組織整體m6A水平來抑制高脂飼糧飼喂小鼠的脂肪沉積，這一作用是通過提高腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4(TNF receptor-associated factor 4，TRAF4)mRNA m6A修飾水平，促進TRAF4的表達，TRAF4進一步通過泛素化修飾降低脂肪組織中PPARγ表達，從而抑制脂肪生成[117]。值得注意的是，由于姜黃素可影響哺乳動物多種組織mRNA中的m6A修飾水平[115,118]，而飼糧中添加200 mg/kg的姜黃素又可以抑制宮內(nèi)生長遲緩仔豬背最長肌中IMF的異位沉積，并通過緩解氧化應激改善宮內(nèi)生長遲緩仔豬的肉質(zhì)[119]。因此，姜黃素是否可以通過影響背最長肌中的m6A修飾水平進而影響IMF沉積值得進一步研究。

6.3 功能性氨基酸影響mRNA m6A修飾調(diào)控動物脂肪沉積

構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)因其功能基團均為支鏈而被合稱為支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAAs)[120]。BCAAs均無法由動物機體自身合成，必需從外界攝取，因此是維持動物機體正常生命活動所必需的氨基酸[120]。BCAAs在腸道中被吸收進入血液循環(huán)后，與大部分氨基酸在肝臟中代謝不同，BCAAs的代謝主要在骨骼肌進行[121]，并廣泛發(fā)生在脂肪、肝臟、腎臟、心肌等多種組織[122]。

近年來，人們越發(fā)關(guān)注BCAAs代謝在脂肪組織中扮演的角色。研究表明，除參與蛋白質(zhì)合成外，BCAAs還能作為信號和代謝分子調(diào)控脂肪組織中的糖脂代謝和能量平衡，BCAA分解代謝是由支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(branched-chain aminotransferase，BCAT)起始的，它由2種異構(gòu)體BCAT1(存在細胞質(zhì)中)和BCAT2(存在于線粒體中)組成。Ma等[123]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織敲除BCAT2促使小鼠的WAT棕色化和產(chǎn)熱增加，進而緩解高脂飼糧誘導的肥胖；進一步機制研究顯示，BCAT2可以將支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化為支鏈酮酸，而支鏈酮酸代謝產(chǎn)生的乙酰輔酶A能夠乙?；疨RDM16 K915位點，進而破壞了PRDM16與PPARγ之間的相互作用，從而抑制WAT棕色化；而敲除BCAT2則會導致脂肪組織棕色化增強并抑制肥胖。在家畜生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BCAAs能調(diào)控豬、牛、羊等的糖、脂代謝，從而影響動物的生產(chǎn)性能[124-126]。在生長肥育豬的低蛋白質(zhì)飼糧中添加BCAAs能顯著增加豬的股二頭肌(biceps femoris，BF)中的IMF含量[127]，而在斷奶仔豬飼喂低蛋白質(zhì)飼糧的同時添加BCAAs可以提高仔豬的采食量和生長性能，并提高仔豬的肌肉含量[128]，但其內(nèi)在機制尚不明確。Heng等[124]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中過量添加BCAAs抑制斷奶仔豬脂肪酸合成的效果，與其能影響脂肪組織中的m6A修飾有關(guān)；與對照組相比，過量添加BCAAs顯著抑制了仔豬背膘脂肪組織中METTL3和METTL14的表達，導致背膘脂肪組織中乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA aarboxylase，ACACA)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)和二?；视王；D(zhuǎn)移酶1(diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1)mRNA上的甲基化水平均顯著降低。本實驗室近期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加BCAAs，通過抑制小鼠WAT組織和3T3-L1細胞中去甲基化酶FTO的表達，使得CCNA2和CDK2 mRNA的m6A水平顯著上升，從而在YTHDF2的介導下抑制CCNA2和CDK2的蛋白表達并阻滯克隆增殖階段細胞周期進程，最終抑制脂肪沉積[129]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BCAAs是通過抑制脂肪細胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)的表達，降低血清和脂肪細胞中還原型輔酶Ⅱ的水平，進而抑制FTO的表達。由于mRNA m6A修飾在豬的脂肪沉積中具有重要作用[49]，BCAAs如何通過mRNA m6A修飾影響豬的脂肪沉積需要進一步深入研究，以便于在豬生產(chǎn)養(yǎng)殖的不同時期，通過控制外源供給BCAAs來促進豬健康生產(chǎn)。

6.4 不飽和脂肪酸調(diào)控mRNA m6A修飾影響動物脂肪沉積

脂肪酸是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，參與細胞內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運體、離子通道、酶或者激素的受體相互作用，調(diào)控多種關(guān)鍵蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)細胞的各項功能，在細胞生長和發(fā)育過程中扮演了重要的角色[130]，其中最受關(guān)注的是不飽和脂肪酸，尤其是長鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，能顯著增加IMF含量，對豬肉的風味和品質(zhì)有著顯著的影響[131]。在各種PUFAs中，亞油酸(linoleic acid，LA)和α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)被認為是脊椎動物的必需脂肪酸，因為體內(nèi)不能合成，必需從飼糧中獲得。研究發(fā)現(xiàn)，豬皮下前體脂肪細胞在亞油酸和α-亞麻酸誘導分化后，細胞增殖數(shù)量、脂質(zhì)含量、油紅O染色程度和成脂相關(guān)標志基因表達量總體上均低于對照組，表明亞油酸和α-亞麻酸通過影響豬皮下前體脂肪細胞增殖、分化和誘導凋亡從而減弱豬脂肪形成[132]。同時，Ostrowska等[133]研究表明，飼糧中添加共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)會顯著提高育肥豬料重比和瘦肉沉積，減少脂肪沉積。李權(quán)[134]在研究魚油對LPS刺激仔豬下丘腦-垂體-腎上腺-免疫軸的影響時發(fā)現(xiàn)，魚油緩解了LPS刺激2 h后引起的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和皮質(zhì)醇含量的提高，同時顯著降低了血漿促腎上腺皮質(zhì)激素含量，探究機制發(fā)現(xiàn)，魚油是通過抑制Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response 88，MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)等炎癥信號通路關(guān)鍵蛋白的表達緩解炎癥因子的分泌的。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6的mRNA上存在多個m6A的甲基化修飾，且這些修飾在炎癥反應過程中對TRAF6的蛋白質(zhì)翻譯有著關(guān)鍵的作用，這提示不飽和脂肪酸很有可能通過調(diào)控mRNA m6A修飾影響動物脂肪沉積[135]。本實驗室通過構(gòu)建m6A修飾關(guān)鍵蛋白缺失的豬腸道上皮細胞系，發(fā)現(xiàn)降低mRNA m6A修飾能夠顯著提高腸道炎癥反應過程中長鏈脂肪酸的吸收攝取和甘油三酯的水平[136]，進一步提示脂肪酸、mRNA m6A修飾和脂質(zhì)沉積之間有著密切的關(guān)系。但是，飼糧添加不同類型的不飽和脂肪酸，通過m6A修飾影響脂肪沉積的內(nèi)在分子機制還需要深入探究。

7 小 結(jié)

綜上所述，國內(nèi)外關(guān)于mRNA m6A修飾與動物脂肪沉積調(diào)控等方面的研究已取得了較大的進展。但由于動物脂肪組織發(fā)育與沉積是一個復雜的生理生化過程，仍存在一些關(guān)鍵問題和可能突破點需要進一步探究，如mRNA m6A甲基化修飾在脂肪干細胞定向成脂分化的機制還有待于進一步探究；mRNA m6A甲基化修飾是否可以差異調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪沉積？其差異調(diào)控機制如何仍需要深入研究；mRNA m6A甲基化修飾及其他表觀遺傳修飾對畜禽脂質(zhì)沉積與代謝的影響有待深入探究；靶向調(diào)控mRNA m6A甲基化修飾的營養(yǎng)素及其在動物生產(chǎn)上的應用技術(shù)體系需研究建立等等。隨著科學技術(shù)的進步和研究的深入開展，mRNA m6A修飾等表觀遺傳修飾對動物脂肪沉積調(diào)控作用及機制將會更加清晰，相關(guān)營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)也將創(chuàng)建，這將為精準靶向調(diào)控動物脂肪沉積進而調(diào)控動物生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對未來綠色高效健康養(yǎng)殖和畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。