趙桓玉 張瑞瑞 張正衛(wèi) 吳建 孫蘇安

Glypican-3(GPC3)是一種膜結(jié)合蛋白多糖，吸附于細胞表面，參與細胞分裂、增殖，編碼GPC-3蛋白，因此可在細胞膜上檢測其表達模式[1,2]。研究證實，肝細胞癌(HCC)患者血清中可檢測到GPC-3，HCC的形成及發(fā)展與GPC-3過表達密切相關(guān)[3-5]。本實驗通過免疫組化檢測HCC患者GPC-3及P53蛋白的陽性表達，探討GPC-3與肝癌患者生存時間的關(guān)聯(lián)，為HCC患者的預(yù)后評估提供參考。

材料與方法

一、研究資料

收集淮安市第一人民醫(yī)院2014年1月至2015年4月91例HCC患者的臨床資料。入組標準：①術(shù)前患者未得到任何治療；②有完好的病理石蠟標本及完整的患者臨床相關(guān)資料；③隨訪截止時間2020年4月1日。

二、試劑和方法

試劑盒包括顯色試劑、抗體、修復(fù)液、封閉試劑等，抗體包括鼠抗人GPC-3抗體(貨號ZM-0146)及鼠抗人P53抗體(貨號ZM-0405)。取距腫塊>1cm的正常肝臟組織32份作為對照組。將標本完全浸泡于中性甲醛24 h后取材、脫水、包埋、冷凍后切片，切片厚度約4 μm，玻片撈出后烤干。在二甲苯中脫蠟，經(jīng)梯度乙醇溶液中脫水。蘇木精伊紅染色，按免疫組織化學(xué)SP法的步驟操作，用已知細胞膜或者細胞質(zhì)GPC-3顯示棕黃色的切片做陽性對照，實驗室自制純凈水代替一抗做陰性對照，滴加DAB顯色液顯色。

三、結(jié)果判定

細胞質(zhì)或細胞膜中GPC-3顯示棕黃色或黃色為陽性。根據(jù)細胞染色的強度和著色細胞的百分率共同評分[6]。采用半定量積分法，打亂實驗分組進行閱片：對于每張切片隨機選擇10個高倍視野，細胞未著色者或微弱著色記0分，細胞膜或細胞質(zhì)顯示淡黃色則為1分，顯示黃色則為2分，顯示棕黃色則為3分；另外根據(jù)記數(shù)細胞內(nèi)著色細胞所占的百分率判斷：≤10%記0分，11%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75% 記3分，76%～100%記4分。兩者相乘為最終得分：≤2分判讀陰性，>2分判讀陽性。P53蛋白陽性可見細胞核顯棕黃色或黃色，依據(jù)陽性細胞的百分率，<10%判讀陰性，≥10%判讀陽性[7]。

四、隨訪

觀察HCC患者總生存時間，總生存期從手術(shù)確診日起至最后隨訪死于原發(fā)腫瘤的死亡時間。隨訪時間至2020年4月。實驗期間死于非腫瘤因素的記為刪失值，失訪患者不納入實驗。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。應(yīng)用χ2檢驗和Fisher精確法對兩樣本及多樣本進行分析比較。采用Kaplan-Meier生存曲線顯示HCC患者術(shù)后生存時間與GPC-3表達的關(guān)系，Log-Rank檢驗分析GPC-3不同表達模式之間生存曲線的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床資料

91例HCC患者中，女性13例，男性78例；中位年齡52歲(25～76歲)。HCC高分化32例、中分化45例、低分化14例。按2018年第8版AJCC的TNM分期標準：Ⅰ期、Ⅱ期共計64例，Ⅲ期、Ⅳ期共計27例。淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移79例，有轉(zhuǎn)移12例。32份癌旁正常肝組織中，有2份(6.3%)GPC-3蛋白陽性，而91份HCC組織中73份(80.2%)GPC-3蛋白陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HCC患者肝組織中GPC-3蛋白表達情況見圖1。

圖1 HCC中GPC-3蛋白的表達(SP×200)

二、GPC-3蛋白的臨床意義

HCC患者GPC-3蛋白的表達與患者年齡、性別、是否伴隨肝硬化及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移無關(guān)(均P>0.05)；與HCC組織學(xué)分級及分期關(guān)系密切(P=0.010、0.011)，組織分化越好及分期越早，GPC-3陽性率越低；與陰性HCC患者相比，P53蛋白的表達在GPC-3陽性HCC患者中明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。見表1。

表1 GPC-3蛋白的臨床意義

三、GPC-3表達對生存時間的影響

73例GPC-3陽性HCC患者中，66例死亡，生存率為9.6%，中位生存時間為33(1～71)個月；18例GPC-3陰性HCC患者中11例死亡，生存率為38.9%，中位生存時間為45(18～72)個月。GPC-3蛋白陽性組生存率和陰性組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.522，P=0.002)。2組患者5年生存率見圖2。

圖2 HCC患者GPC-3表達陰性和陽性者5年生存率

討 論

治療HCC方法很多，但治療效果不佳，因此探討新的分子靶向藥物日益受到關(guān)注[8]。研究表明，相對于非癌肝組織及癌周組織，GPC-3在肝癌組織中表達增加，因此被認為是診斷HCC特異性和敏感性標志及靶向治療最有前景的生物標記[9-11]。本研究結(jié)果顯示，在HCC中GPC-3蛋白表達顯著增高，為80.2%，而癌旁肝組織僅為6.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

體外分子研究推測GPC-3與Wnt通路有關(guān)，Wnt蛋白與其受體結(jié)合激活GPC-3基因，GPC-3基因發(fā)生改變而導(dǎo)致GPC-3蛋白過表達，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12,13]。P53為抑癌基因，其參與基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞生長。當P53突變時，喪失調(diào)節(jié)功能，無法進行DNA損傷修復(fù)[14]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPC-3陽性HCC患者P53表達升高，與GPC-3陰性HCC患者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示P53與Wnt通路之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，但結(jié)論有待于大樣本的驗證。

本研究通過檢測91例HCC患者中GPC-3蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)GPC-3蛋白表達與患者組織學(xué)分級及TNM分期具有相關(guān)性，而與患者年齡、性別、有無肝硬化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。研究證實，GPC-3在多種人類腫瘤中均有表達，并且認為GPC-3蛋白的高表達是預(yù)后差的一個危險因素[15]。本研究結(jié)果顯示，91例HCC患者5年總生存率約15.4%。GPC-3陽性組HCC患者與GPC-3陰性組HCC患者生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明GPC-3的表達對HCC患者的預(yù)后有明顯影響。

本研究證實GPC-3 可作為肝細胞癌早期診斷指標，對評估HCC患者預(yù)后情況具有潛在的價值，因此，GPC-3有可能成HCC患者的治療新靶標。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。