王瑋 沙鈞平 丁鋒 王新明

肝切除、移植和局部消融對(duì)早期肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者具較好療效[1-3]。索拉非尼和瑞戈非尼可使晚期患者的總生存期延長(zhǎng)2～3個(gè)月，但常伴有治療引起的不良事件，如低磷血癥、體重減輕、手足皮膚反應(yīng)、高血壓等[4-6]。免疫療法可有效治療多種癌癥[7-9]。CAR T細(xì)胞療法依賴自體或同種異體T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)基因改造表達(dá)合成CAR/TCR，將它們重定向并攻擊和殺死表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞[10-12]。盡管甲胎蛋白(AFP)作為癌癥特異性抗原具有吸引力，但AFP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌，因此無(wú)法與傳統(tǒng)的基于抗體的療法一起使用[13]。在人類細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)都被加工成肽并由細(xì)胞表面的I類MHC呈遞。目前已在小鼠和人類中鑒定出AFP/MHC特異性TCR，表明AFP-MHC復(fù)合物具有免疫原性[14]。本研究探討以AFP-MHC復(fù)合物為靶向的CAR T細(xì)胞治療肝癌的效果。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自廣州珍尼奧生物科技有限公司，HepG2細(xì)胞在37°C的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從太平洋血液中心獲得健康人類外周血白細(xì)胞，使用EasySep人類T細(xì)胞分離試劑盒(上海碧云天公司)分離T細(xì)胞。將雙特異性抗體ET1402L1設(shè)計(jì)成包含CD28/CD3共刺激域的第二代CAR，將CAR構(gòu)建體克隆到慢病毒載體中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人T細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)小鼠：40只雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量21～25 g，4～6周齡，在無(wú)特定病原體(SPF)條件下飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h。小鼠接受無(wú)菌嚙齒動(dòng)物飼料和隨意飲水。該方案經(jīng)省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

肝癌小鼠異種移植模型：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在Murigenics進(jìn)行。皮下腫瘤模型：在植入前將細(xì)胞與50% Matrigel混合，并通過(guò)卡尺測(cè)量腫瘤。HepG2腫瘤模型；每只小鼠植入2.5×106個(gè)細(xì)胞；腹膜內(nèi)研究，將2.5×106HepG2-luc2 細(xì)胞注射到PBS中，并使用IVIS成像系統(tǒng)通過(guò)總發(fā)光通量測(cè)量腫瘤。

實(shí)驗(yàn)分組：每周通過(guò)測(cè)量腫瘤衍生的生物發(fā)光來(lái)評(píng)估腫瘤負(fù)荷，將小鼠隨機(jī)分配為腫瘤模型組20只和AFP-CAR T靶向治療組20只。腫瘤模型組腹膜注射供體匹配的T細(xì)胞(模擬)，AFP-CAR T靶向治療組小鼠腹膜內(nèi)注射107個(gè)AFP-CAR T細(xì)胞。

二、方法

肽由Elim Biopharmaceuticals合成。生物素化的AFP158/人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*02:01復(fù)合物是通過(guò)在肽和β2-微球蛋白(β2M)存在下重折疊重組HLA-A*02:01產(chǎn)生。鏈霉親和素-PE偶聯(lián)的AFP158/HLA-A*02:01四聚體(PE-四聚體)由Eureka Therapeutics制造。通過(guò)細(xì)胞淘選和產(chǎn)生針對(duì)AFP158/HLA-A*02:01復(fù)合物的IgG1抗體選擇對(duì)AFP158/HLA-A*02:01具有特異性的人抗體。

AFP-CAR T細(xì)胞的產(chǎn)生：抗AFP158/HLA-A*02:01 scFv被移植到第二代CAR上，CD28和CD3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域順式設(shè)計(jì)以提供細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞刺激信號(hào)。CAR序列被克隆到pCDH慢病毒載體(Sigma公司，美國(guó))中，遞送到T細(xì)胞。人T細(xì)胞在含10% FBS的RPMI1640中培養(yǎng)，并用CD3/CD28 Dynabeads(Sigma公司，美國(guó))激活。激活后1 d，在RetroNectin包被的平板中用濃縮的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人T細(xì)胞。在100 U/mL IL-2(Sigma公司，美國(guó))或10 ng/mL IL-7和5 ng/mL IL-15存在下將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞擴(kuò)增8～12 d。使用鏈霉親和素-PE偶聯(lián)的AFP158/HLA-A*02:01四聚體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

細(xì)胞裂解和增殖試驗(yàn)：雙特異性抗體(BsAb)形式的克隆體ET1402L1在指定濃度下與T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以5∶1的E∶T比例孵育16 h。通過(guò)LDH釋放測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞裂解率。克隆體ET1402L1與T細(xì)胞、HepG2細(xì)胞移植到96孔板中，使用CCK-8試劑盒(Sigma公司，美國(guó))在第1、3、5和7天檢測(cè)細(xì)胞的A值，在450 nm下用分光光度法測(cè)量溶液。

定量實(shí)時(shí)PCR：提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR-Green方法(Sigma公司，美國(guó))在Bio-Rad CFX96定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)靶基因的相對(duì)表達(dá)，95°C 15 min，94°C 15 s、55°C 30 s、63°C 30 s，40個(gè)循環(huán)。U6和β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照。

血清AFP檢測(cè)：ELISA試劑盒分析小鼠的血清AFP水平。

腫瘤治療效果的Micro-CT掃描評(píng)估：采用碘海醇(350 mg I/ml)進(jìn)行臟器造影成像，X光管電壓55 KVp，功率60 W。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

第1天兩組細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第3、5、7天，AFP-CAR T細(xì)胞組細(xì)胞增殖較HepG2組降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果(±s)

二、AFP-CAR T細(xì)胞在體外特異性殺傷HepG2

HepG2組細(xì)胞裂解率為(8.24±2.33)%，AFP-CAR T細(xì)胞組細(xì)胞裂解率為(72.19±8.32)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、細(xì)胞因子的表達(dá)

AFP-CAR T細(xì)胞組TNFα、IFNγ、IL-2和IL-10 mRNA表達(dá)較HepG2組升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)結(jié)果(±s)

四、AFP-CAR T細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)

第0天兩組小鼠腫瘤大小比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第10、20、30、40天，AFP-CAR T靶向治療組腫瘤大小較腫瘤模型組減小(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 異種移植腫瘤生長(zhǎng)檢測(cè)(±s)

五、AFP-CAR T細(xì)胞降低腫瘤小鼠AFP水平

腫瘤模型組AFP為(2564.18±265.19)μg/mL，AFP-CAR T靶向治療組AFP為(837.49±63.22)μg/mL(P<0.05)。

六、腫瘤治療效果的Micro-CT掃描評(píng)估

AFP-CAR T靶向治療組腫瘤直徑為(529.25±39.27)mm，較腫瘤模型組(69.58±15.65)mm顯著減小(P<0.05)。

討 論

雖然HCC通常不被認(rèn)為是免疫原性腫瘤，但腫瘤中淋巴細(xì)胞水平高的HCC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低，預(yù)后較好。研究發(fā)現(xiàn)，射頻消融后外周血中循環(huán)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞比例升高可降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[15]。這表明，HCC患者會(huì)產(chǎn)生抑制疾病進(jìn)展的抗腫瘤免疫。過(guò)去研究確定了HCC中的腫瘤相關(guān)抗原及其各自的T細(xì)胞表位，從而證實(shí)存在T細(xì)胞介導(dǎo)的HCC免疫反應(yīng)?；蛐揎椀腡細(xì)胞療法已被開(kāi)發(fā)為一種遞送特定于不同類型癌癥的T細(xì)胞方法。它使用經(jīng)過(guò)基因改造的T細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生識(shí)別腫瘤抗原及其表位的TCR，CAR的細(xì)胞內(nèi)部分是通過(guò)共刺激分子與TCR的細(xì)胞內(nèi)部分[16，17]。

CAR-T細(xì)胞是由病毒載體修飾以表達(dá)CAR的T細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞不受HLA的限制，因?yàn)镃AR-T細(xì)胞的抗原識(shí)別位點(diǎn)由特異性識(shí)別腫瘤表面抗原的單克隆抗體組成[18, 19]。CD19-CAR-T細(xì)胞療法使復(fù)發(fā)性和難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者的完全緩解率約達(dá)50%[20]。針對(duì)實(shí)體瘤的T細(xì)胞療法主要阻礙因素之一是缺乏可靶向的腫瘤特異性抗原。本研究利用之前開(kāi)發(fā)的抗體來(lái)識(shí)別和優(yōu)化針對(duì)與HLA-A*02:01復(fù)合的AFP158肽的高度特異性抗體，使用由該抗體構(gòu)建的第二代CAR的重定向T細(xì)胞療法在HepG2的肝癌腫瘤模型中顯示出抗腫瘤活性。這將適用于作為實(shí)體瘤特異性靶標(biāo)的許多其他細(xì)胞內(nèi)抗原。此外，通過(guò)將肽-MHC復(fù)合物特異性的scFv工程化到第二代CAR平臺(tái)中，規(guī)避了與傳統(tǒng)CAR(不能靶向細(xì)胞內(nèi)抗原)和TCR相關(guān)的一些缺點(diǎn)。一方面，避免了工程化TCR與內(nèi)源性TCR的錯(cuò)配，這大大降低了脫靶效應(yīng)的機(jī)會(huì)。與傳統(tǒng)的工程化TCR不同，后者與內(nèi)源性TCR競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)并需要外部共刺激信號(hào)來(lái)啟動(dòng)完整的免疫反應(yīng)，第二代CAR可以通過(guò)其雙信號(hào)受體(即CD28/CD3)。因此，這種scFv-CAR設(shè)計(jì)能夠以極好的選擇性靶向細(xì)胞內(nèi)和分泌的抗原，同時(shí)提供通常用CAR實(shí)現(xiàn)的效力。本研究中，基于AFP在HCC中的表達(dá)模式及其已證明的免疫原性，開(kāi)發(fā)了ET1402L1，這是一種全人源抗體，可選擇性結(jié)合HLA-A*02:01呈遞的AFP158-166(AFP158)肽，這是最普遍的I類人群中的MHC。將這種TCR樣抗體設(shè)計(jì)成第二代CAR，使抗原識(shí)別與直接有效的免疫效應(yīng)活性結(jié)合起來(lái)。本研究用ET1402L1-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，裂解靶細(xì)胞并抑制HepG2的增殖，同時(shí)可釋放細(xì)胞因子并殺死HepG2靶細(xì)胞。此外，AFP-CAR T細(xì)胞可顯著降低小鼠血清AFP水平，證明了這種免疫治療方法在實(shí)體瘤環(huán)境中的有效性。

綜上所述，以AFP-MHC復(fù)合物為靶向的CAR T細(xì)胞靶向細(xì)胞內(nèi)分泌的腫瘤抗原產(chǎn)物是有效的。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。