何達(dá)，張莉

（榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 榆林 719000）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是一種嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥，其病死率為30%～40%。ALI 通常以炎癥細(xì)胞聚集、血管和上皮通透性增加、間質(zhì)水腫、氣體交換異常和肺泡間隔損傷為特征，但治療ALI 的有效藥物很少[1]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌的一種成分，通常會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和肺損傷[2]。LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷是一種廣泛應(yīng)用于ALI病理和藥物干預(yù)研究的動物模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明鼻內(nèi)注射LPS 可顯著增加炎癥細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[3]。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種高度選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑，臨床上用于患者的鎮(zhèn)靜[4]。DEX 具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，可通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用預(yù)防LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷[5]。DEX 預(yù)處理可通過抑制受Toll 樣受體4（TLR-4）/核因子-κB（NF-κB）信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生來減輕敗血癥引起的急性肺損傷[6]。DEX通過下調(diào)高遷移率族box-1 蛋白（HMGB1）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（RAGE）通路受體來減輕膿毒癥刺激的急性肺損傷。另外，在IL-17 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，DEX 以劑量依賴性方式降低了IL-17 的炎癥作用，并通過降低連接蛋白-43 蛋白水平抑制間隙連接功能，顯著減少LPS 誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞系凋亡。近期，有研究發(fā)現(xiàn)DEX 通過靶向miR‐381抑制NLRP3炎性小體活化[7]。但DEX是否以劑量依賴性抑制NLRP3 炎性小體活化介導(dǎo)的急性肺損傷尚不清楚，因此，本研究的主要目的是評價(jià)不同劑量的DEX 對LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用，并探究是否與NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

右美托咪定注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥（國藥準(zhǔn)字H20090248）；TNF-α（430907）、IL-1β（740865）、IL-6（431307）和MCP-1（446207）小鼠ELISA試劑盒購自BioLegend 生物公司（美國）；一抗NLRP3（15101）、ASC（67824）、Caspase-1 p20（24232）、IL-1βp17（12703）和β-Actin（4970）均購自CST 生物公司（美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6 小鼠（6～8 周）25 只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2020-001。

1.3 分組與給藥

將25只小鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為對照組、模型組、DEX 12.5 μg/kg（低劑量）組、DEX 25 μg/kg（中劑量）組和DEX 50 μg/kg（高劑量）組，每組5只。根據(jù)文獻(xiàn)[6]，鼻腔給予10 μg LPS[溶解于50 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）]誘發(fā)急性肺損傷。對照組和模型組均預(yù)先30 min腹腔注射生理鹽水，DEX 各組按照劑量預(yù)先30 min腹腔注射相應(yīng)劑量的DEX。然后，除對照組外，各組均鼻腔給予LPS，對照組給予PBS。LPS 處理6 h 后，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，然后插入氣管插管，用0.4 mL預(yù)冷PBS沖洗肺部3次，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）以及肺組織。

1.4 BALF炎癥因子含量評價(jià)

以3 000g離心10 min，收集上清液于EP 管，并儲存于-80 ℃或直接檢測。使用ELISA試劑盒檢測小鼠BALF 中TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 的含量，于450 nm處測量吸光度（A），計(jì)算含量。

1.5 肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量（wet-dry weight,W/D）值評價(jià)

用濾紙擦拭右肺中葉，并稱質(zhì)量，即濕質(zhì)量（W）。隨后，將肺組織放入烘箱中，在60 ℃下干燥48 h，然后再次稱重，即干質(zhì)量。計(jì)算濕質(zhì)量與干質(zhì)量比值，即W/D值。

1.6 小鼠BALF總蛋白評價(jià)

采用BCA 法測定BALF 蛋白濃度，用于評價(jià)肺血管通透性。

1.7 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)

收集BALF，于4 ℃下以400g離心10 min，棄上清，1.0 mL PBS 重懸細(xì)胞。固定細(xì)胞并離心，加入瑞氏-吉姆薩（Wright-Giemsa）復(fù)合染色液評估細(xì)胞形態(tài)，對于每種細(xì)胞類型，采用光學(xué)顯微鏡檢查并計(jì)算數(shù)量。

1.8 病理評價(jià)

取右肺上葉組織，放入4%（φ）多聚甲醛中過夜固定，用自來水沖洗5 min，石蠟包埋，切片（5 μm），然后用蘇木精和伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡分析組織病理學(xué)。根據(jù)出血、肺泡充血、中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡擴(kuò)張對肺損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，5分評分系統(tǒng)：0：無；1：輕微；2：適中；3：嚴(yán)重；4：非常嚴(yán)重[8]。

1.9 蛋白印跡

稱量約50 mg 肺組織樣品，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液中裂解30 min。用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離后，將40 mg 蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜用封閉液（5%脫脂奶粉）封閉1 h，然后與特定的一抗（NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、IL-1βp17和β-Actin，按1∶1 000稀釋）在4 ℃下孵育過夜。第2 天，在用PBST 洗滌3 次后，將膜與HRP 耦聯(lián)的二抗（1∶10 000 稀釋）在室溫下再孵育1 h。最后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并采用Image軟件灰度掃描。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以表示，使用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單向方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF中炎癥因子含量比較

與對照組比較，模型組小鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1含量顯著升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠BALF中炎癥因子含量比較Figure 1 Comparison of inflammatory factors in BALF of mice in each group

2.2 各組小鼠肺W/D值和BALF蛋白含量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺W/D 值和BALF蛋白含量明顯升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠肺W/D 值和BALF 蛋白含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

圖2 各組小鼠肺W/D值和BALF蛋白含量比較Figure 2 Comparison of lung W/D value and BALF protein content of mice in each group

2.3 各組小鼠BALF 中總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)比較

與對照組比較，模型組小鼠BALF總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠BALF 總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見圖3。

圖3 各組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果Figure 3 Comparison of the number of total cells，neutrophils and macrophages in BALF of mice in each group

2.4 各組小鼠肺組織病理HE染色比較

相較于對照組，模型組和低劑量組小鼠觀察到肺組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)（水腫、炎性細(xì)胞浸潤）；相較于模型組，DEX 中劑量組和高劑量組小鼠炎性細(xì)胞浸潤緩解，表現(xiàn)為肺泡壁厚度和病理評分降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織病理HE染色比較結(jié)果Figure 4 Comparison of HE staining results of lung tissue pathology of mice in each group

2.5 各組小鼠肺組織中NLRP3炎性小體表達(dá)比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 p20 和IL-1βp17 蛋白表達(dá)水平顯著升高；相較于模型組小鼠，DEX 低、中、高劑量組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 p20 和IL-1βp20 蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織中NLRP3炎性小體表達(dá)比較結(jié)果Figure 5 Comparison of the expression of NLRP3 inflammasome in lung tissues of mice in each group

3 討論

膿毒癥是ALI 的常見原因，約占所有ARDS 病例的25%[9]。LPS 誘導(dǎo)的ALI 具有多種病理生理學(xué)特征，并與相互關(guān)聯(lián)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)展有關(guān)；促炎細(xì)胞因子在導(dǎo)致肺損傷的炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用[10-11]。LPS 誘導(dǎo)的ALI 模型與肺中性粒細(xì)胞的積累和巨噬細(xì)胞的激活有關(guān)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和細(xì)胞的釋放，增加肺泡-毛細(xì)血管通透性。本研究發(fā)現(xiàn)DEX 治療組小鼠BALF 中總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯降低，BALF 蛋白含量降低，這些結(jié)果說明DEX 能有效降低ALI 小鼠的肺泡-毛細(xì)血管通透性。同時(shí)，DEX 明顯降低了ALI 小鼠BALF 中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 含量，這些因子與炎性細(xì)胞浸潤肺部密切相關(guān)[12-13]。ALI 的病理特征表現(xiàn)為多形核中性粒細(xì)胞、纖維蛋白沉積物、肺泡出血和肺水腫液積聚相關(guān)的急性炎癥反應(yīng)[14-15]。和預(yù)期的一樣，DEX 明顯緩解了ALI小鼠的肺部病理損傷，包括炎性細(xì)胞浸潤緩解，即肺泡壁厚度和病理評分降低。這些說明DEX 具有明顯的抗ALI 小鼠的肺部炎癥反應(yīng)，并且給藥濃度為12.5 μg/kg 時(shí)，依然具有顯著的抗炎活性，包括緩解肺泡-血管通透性和炎癥因子產(chǎn)生。

據(jù)報(bào)道，DEX預(yù)處理可上調(diào)Cav-1的表達(dá)，降低髓過氧化物酶活性和炎癥細(xì)胞浸潤，緩解肺組織病理損傷，抑制炎癥反應(yīng)以減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI[16]。另外，DEX 能抑制ALI 小鼠肺組織TLR-4 和NF-κB的表達(dá)，并且DEX 通過抑制HMGB1 介導(dǎo)的TLR-4/NF-κB 和PI3K/Akt/mTOR 途徑從而緩解LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷[17]。除了抗炎反應(yīng)外，DEX 通過抑制間隙連接蛋白和降低連接蛋白-43 的蛋白表達(dá)減少LPS 誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞凋亡，并維持肺泡-毛細(xì)血管的通透性[18]。DEX 也通過激活Nrf2/Keap1 信號通路和調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)改善LPS 誘導(dǎo)的肺部炎癥和氧化應(yīng)激[19]。上述文獻(xiàn)報(bào)道了DEX 的抗炎相關(guān)通路，但大多涉及TLR4 介導(dǎo)的信號途徑。近期有研究[20]發(fā)現(xiàn)DEX（25 μg/kg）通過靶向miR‐381 抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 炎性小體活化，但DEX 是否呈劑量依賴性抑制ALI 小鼠NLRP3 炎性小體活化尚不清楚。本研究探討了不同劑量的DEX對NLRP3炎性小體活性的影響。

炎性小體是一類位于細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物，在先天免疫中發(fā)揮重要作用，炎性小體控制促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌，包括IL-1β、IL-18 和細(xì)胞焦亡。NLRP3 炎性小體由NOD 樣受體（NLRP3）、銜接蛋白ASC 和Caspase-1 組成，是一種重要的細(xì)胞內(nèi)多蛋白炎癥復(fù)合體[21]。在各種刺激（微生物和應(yīng)激物質(zhì)等）下，NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 組裝，形成聚合體，切割pro-Caspase-1 激活Caspase-1，并切割pro-IL-1β形成成熟的IL-1β[22]。之前研究發(fā)現(xiàn)DEX（25 μg/kg）能抑制ALI小鼠肺組織中NLRP3和Caspase-1 p20 的表達(dá)，并降低血清IL-1β水平[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEX 不僅能抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 和Caspase-1 p20 表達(dá)，并降低ASC（炎性小體組裝的關(guān)鍵蛋白）和IL-1βp17（即成熟型IL-1β）表達(dá)。這些結(jié)果說明DEX 可能是通過抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 炎性小體的活化而降低ALI 小鼠全身炎癥反應(yīng)（即血清炎癥因子水平降低），并緩解組織損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DEX 對LPS 誘導(dǎo)的ALI小鼠具有保護(hù)作用，包括緩解肺損傷、肺水腫和炎癥反應(yīng)，并呈劑量依賴性抑制NLRP3 炎性小體活化。但DEX 的抗炎作用涉及多種信號通路，包括TLR4 介導(dǎo)的信號等，這些信號之間是否密切相關(guān)或涉及其他信號調(diào)節(jié)仍不清楚。后續(xù)研究會進(jìn)一步研究DEX抗ALI損傷的確切機(jī)制。