常滿，李曉飛，何芍瑩，賀炳凱，范輝

（廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心/糖脂代謝病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝降脂重點(diǎn)研究室/廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院/廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

短鏈脂肪酸（SCFAs）是由腸道微生物代謝產(chǎn)生、少于7個(gè)碳原子的一類有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸[1]。人體糞便樣品中的SCFAs 以乙酸、丙酸和丁酸為主[2-3]。研究表明，SCFAs是一種重要的信號(hào)分子，可與其特異性受體相互作用[4]，對(duì)腸道有氧化、維持水電解質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能、抗炎、抗腫瘤和調(diào)控基因表達(dá)等重要作用；在多個(gè)水平上影響糖脂質(zhì)代謝，既參與脂肪的合成又有一定程度抑制作用；作為腸道菌群重要的代謝物，SCFAs可通過對(duì)多個(gè)系統(tǒng)的影響，協(xié)同發(fā)揮其廣泛生理作用，提高機(jī)體抗病力，維護(hù)機(jī)體健康[5-10]。

SCFAs為揮發(fā)性脂肪酸，易逸失，直接測(cè)定難度大，測(cè)定方法多采用高效液相色譜法、氣相色譜法等[11]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道糞便類樣本的SCFAs 測(cè)定方法，樣品前處理復(fù)雜，干擾峰多，靈敏度不高[12]。本研究收集人的糞便樣品，建立一種新穎的柱前甲基衍生化GC-MS 技術(shù)對(duì)糞便樣本中的SCFAs 進(jìn)行定性定量分析，擬為腸道菌群功能的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977B GC-MS 氣相色譜質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；DB-23 色譜柱（安捷倫科技有限公司）；5180R 低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）；Vortex-3 漩渦混合器（德國IKA 公司）；BT2245 電子天平（德國sartorius）；BCD-266CM -80 ℃冰箱（美的集團(tuán)有限公司）。

對(duì)照品乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸均購于德國DR 公司（批號(hào)分別為CDCT-C10015500、CDCTC16493000、CDCT-C14395500、CDCT-C14479470）；丁酸（批號(hào)CDDE-N-4-A-1GM，NU-CHEK 公司）；戊酸（批號(hào)CDAE-75054-1ML，Sigma 公司）；4-甲基戊酸（批號(hào)M813962，麥克林Macklin 公司）；甲醇（色譜純，批號(hào)M813962，德國Merck 公司）；3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨5% 甲醇溶液（批號(hào)IH0096-0，TCI 公司）；三氯甲烷（分析純，麥克林公司）；濃硫酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；超純水（生物級(jí)，屈臣氏蒸餾水公司）。

1.2 溶液的制備

1.2.1 糞便收集 招募健康志愿者，受試者在開展受試前簽署書面通知書并完成倫理審批。采樣前備好干冰及冰盒，無菌杯采集新鮮糞便，糞樣收集后，迅速放入干冰盒中冷凍。完成采樣后，將樣本立即凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取4-甲基戊酸內(nèi)標(biāo)物適量置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋，配制成內(nèi)標(biāo)溶液（4-甲基戊酸0.42 mmoL/L）。精密量取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸短鏈脂肪酸對(duì)照品，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成短鏈脂肪酸對(duì)照品混合儲(chǔ)備液（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度分別為36.00、14.40、14.40、14.40、12.00、12.00 mmoL/L）。再精密量取各混合儲(chǔ)備液1.0 mL 于2.0 mL 或5.0 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，依次制備成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，見表1。

表1 混合對(duì)照品溶液的濃度Table 1 Concentration of mixed reference substancec/（mmoL·L-1）

精密量取各混合對(duì)照品溶液100 μL 于EP 管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，再精密加入100 μL衍生化試劑3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（5%甲醇溶液），用封口膜封口，充分混勻后，常溫下靜置反應(yīng)60 min，完成后即可上樣檢測(cè)（甲基化反應(yīng)）。

1.2.3 糞便供試品溶液的制備 精密稱取150 mg糞便樣本，加入500 μL 三氯甲烷濃硫酸溶液（取適量的三氯甲烷于50 mL離心管中，緩慢加入濃硫酸，調(diào)節(jié)其pH 值至2.0～3.0），渦旋10 min，充分混勻，冰上靜置5 min，12 000 r/min 下離心10 min，取下清液于1 mL EP 管中，再次12 000 r/min 下離心5 min。取上述兩次離心后的下清液100 μL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，最后精密加入3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（5%甲醇溶液）試劑100 μL，用封口膜封口，常溫靜置反應(yīng)60 min，即為糞便供試品溶液。

1.3 測(cè)定條件

色譜條件：色譜柱DB-23 石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃保持0.5 min，58 ℃保持3 min，70 ℃保持2 min，120 ℃保持1 min，最后240 ℃保持10 min，總運(yùn)行36.5 min，見表2。

表2 氣相色譜升溫條件Table 2 Gas chromatography heating conditions

質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度：230 ℃；電子轟擊能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲時(shí)間4.5 min；采用選擇離子掃描方式（掃描范圍m/z：40～500）。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在上述色譜質(zhì)譜條件下，混合對(duì)照品溶液、糞便樣品溶液的6 種短鏈脂肪酸、內(nèi)標(biāo)物實(shí)現(xiàn)完全分離，根據(jù)總離子流圖（圖1）和成分質(zhì)譜圖（圖2）可以確定衍生化短鏈脂肪酸的各組分定性、定量離子（表3）。

表3 7種化合物的定性、定量離子Table 3 Qualitative and quantitative ions of seven compounds

圖1 混合對(duì)照品溶液（a）和糞便供試品溶液（b）的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatograms of the mixed standard solution（a）and the fecal sample solution（b）

圖2 供試品中主要成分質(zhì)譜圖Figure 2 Mass spectrograms of main components in the sample

2.2 線性關(guān)系

取配置好的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下方法發(fā)生甲基化反應(yīng)后，按“1.3”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用加權(quán)最小二乘法作線性回歸，得回歸方程。進(jìn)樣分析得到6 種化合物相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方程，以待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），待測(cè)物濃度（mmoL/L）為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行加權(quán)最小二乘法作線性回歸，得各化合物線性方程，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)均r>0.999，各化合物線性范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，見表4。以信噪比10∶1 確定各化合物的方法結(jié)果定量下限均達(dá)到0.1 μmoL/L，靈敏度高。

2.3 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)

取中間濃度（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度分別為1.5、0.6、0.6、0.6、0.5、0.5 mmoL/L）混合對(duì)照品溶液濃度連續(xù)進(jìn)樣6 次分析，結(jié)果顯示各短鏈脂肪酸的峰面積RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

取同一糞便樣品6份按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析平行6份相同糞便樣品中，結(jié)果顯示各短鏈脂肪酸的含量RSD值均小于5.0%，表明方法重復(fù)性好。

取同一糞便樣品按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，于0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示樣本中24 h內(nèi)6種短鏈脂肪酸的含量RSD值均小于8.0%，表明供試品溶在室溫下24 h穩(wěn)定性良好。

以上結(jié)果均符合生物樣本檢測(cè)的基本要求，見表4。

表4 線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Results of linear relationship,precision,repeat ability and stability

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

取已知濃度的同一糞便樣品75 mg，分別加入約相當(dāng)于樣品質(zhì)量的混合對(duì)照品溶液，各對(duì)照品加入量按80%、100%、120%的低、中、高3 種濃度組配置，每組平行制備3份樣品，按“1.2.3”項(xiàng)方法處理樣本后，按“1.3”項(xiàng)色譜、質(zhì)譜條件檢測(cè)各樣品中SC‐FAs 的含量，計(jì)算回收率及RSD 值，見表5。結(jié)果顯示，樣本中各個(gè)SCFAs 測(cè)得的RSD 大部分小于10.0%，表明方法的提取回收率良好，符合生物樣本檢測(cè)的要求。

表5 糞便中SCFAs提取回收率Table 5 Recovery rate of SCFAs extraction from feces(n=3)

2.5 樣品中短鏈脂肪酸的含量測(cè)定

收集糞便后，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定各個(gè)化合物的峰面積后，代入表4的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得出各脂肪酸的濃度見表6。

表6 短鏈脂肪酸的測(cè)定Table 6 Determination of short-chain fatty acids(n=3)

3 討論

目前，GC法、GC-MS法分析脂肪酸時(shí)采用的柱前衍生法多為甲酯化法[13]。甲酯化法使羧基與醇羥基酯化反應(yīng)生成相應(yīng)的脂肪酸甲酯，通常采用酸催化（濃硫酸）、堿催化（氫氧化鉀）進(jìn)行酯化反應(yīng)。濃硫酸催化產(chǎn)物多，影響成分分離，且過量硫酸需要氮?dú)獯蹈?，步驟提取程序復(fù)雜。堿催化甲酯化法不適合游離型脂肪酸，適合甘油三酯型脂肪酸[13]。三氟化硼催化法[14-16]，存在步驟繁瑣，加標(biāo)回收率低，溶液毒性較強(qiáng)，易于揮發(fā)，加熱時(shí)易變成毒性更大的氟化氫等有害物質(zhì)的缺點(diǎn)。

本研究對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行了考察，比較了乙酸乙酯、正己烷、乙醚、三氯甲烷與50%濃硫酸按1∶10的比例混合作為有機(jī)提取溶劑的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：使用乙酸乙酯提取時(shí)，溶劑會(huì)與組分乙酸出現(xiàn)共流出峰現(xiàn)象；使用正己烷提取時(shí)，提取率比三氯甲烷低，色譜峰峰形不理想；使用乙醚時(shí)，揮發(fā)性較強(qiáng)，導(dǎo)致樣本定量結(jié)果不穩(wěn)定；而使用三氯甲烷作提取溶劑時(shí)，提取效率較高，且處理后可得到比較澄清的樣本，雜質(zhì)較少，峰形較好。綜合考慮，選用三氯甲烷加50%濃硫酸按照1∶10比例混合，作為糞便產(chǎn)物的提取試劑。

本研究采用的3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（TMTFTH）的成酯反應(yīng)是一種熱裂解的甲基化反應(yīng)所生成的脂肪酸甲酯，反應(yīng)原理見圖3。該反應(yīng)屬于烷基化反應(yīng)，TMTFTH 是季胺堿，化學(xué)反應(yīng)包含兩個(gè)連續(xù)的過程：第一步是在季胺堿的作用下，脂肪酸羧基去質(zhì)子，與季胺堿形成相應(yīng)的季胺鹽，這一過程反應(yīng)產(chǎn)物為有機(jī)酸有機(jī)堿鹽，物質(zhì)穩(wěn)定，決定了方法的穩(wěn)定；第二步是上述季胺鹽在氣相色譜進(jìn)樣口處進(jìn)一步熱分解成三甲基叔胺和相應(yīng)的羧酸甲酯衍生物，該反應(yīng)屬于陰離子的親核反應(yīng)，這一步反應(yīng)在氣相色譜進(jìn)樣口溫度250 ℃的條件下，瞬間分解為易揮發(fā)的羧基甲酯。熱裂解的甲基化反應(yīng)雖然生成的是羧基甲酯，但反應(yīng)原理不同于酯化反應(yīng)。熱裂解的甲基化反應(yīng)省去萃取、氮吹、蒸發(fā)等復(fù)雜步驟，加樣反應(yīng)后離心，取下清液即為待測(cè)液。該方法較好地解決了短鏈脂肪酸分析中存在的易逸失、衍生化反應(yīng)不完全、提取步驟復(fù)雜等瓶頸問題。

圖3 柱前甲基化反應(yīng)原理Figure 3 Principle of pre-column methylation reaction

本研究建立了一種柱前甲基衍生化GC-MS 法測(cè)定人糞便短鏈脂肪酸的方法，利用GC-MS聯(lián)用法對(duì)微量樣品的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)衍生化方法，以濃硫酸水解，減少離心次數(shù)，梯度洗脫增強(qiáng)靈敏性。該方法操作簡便、快速、靈敏，且樣品前處理簡單、反應(yīng)原理新穎、切實(shí)可行，適用于人糞便樣本中短鏈脂肪酸含量的檢測(cè)，為提升腸道菌群功能的科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。