列靜怡，曾靖敏，趙炳權(quán)，王巖，王嬰

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)中山校區(qū)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 中山 528453）

羥基喜樹堿（10-hydrocamptothecin，HCPT）是從藍(lán)果樹科喜樹屬植物喜樹中提取的一種單體生物堿。研究表明，HCPT 對多種惡性腫瘤具有較好療效，主要用于治療肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等癌癥[1-3]，對腫瘤細(xì)胞有致死性損害作用[4]。羥基喜樹堿具有內(nèi)酯型（閉環(huán)HCPT）和羧酸鹽型（開環(huán)HCPT）2 種存在形式，閉環(huán)HCPT 水溶性很差，臨床上使用的是其鈉鹽注射液，由于結(jié)構(gòu)中活性必需基團(tuán)內(nèi)酯環(huán)被打開，HCPT 主要以開環(huán)形式存在，抗腫瘤活性降低[5]。

脂質(zhì)體作為藥物載體近年來受到廣泛關(guān)注，可將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)進(jìn)行運(yùn)載，避免藥物在水環(huán)境和血液中失去活性，大大提高藥物的治療指數(shù)和療效；脂質(zhì)體的緩釋作用還可解決藥物半衰期短、患者順應(yīng)性差等問題[6]。

本研究為提高HCPT 的體內(nèi)抗腫瘤活性，將它制備成脂質(zhì)體（HCPT-LP），進(jìn)一步以包封率為指標(biāo)優(yōu)化其制備工藝，采用Box Behnken-響應(yīng)面法，對藥物在水合介質(zhì)的濃度、包封溫度、卵磷脂與藥物質(zhì)量比、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比等參數(shù)進(jìn)行篩選，為羥基喜樹堿臨床新制劑的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UltiMate 3000 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 粒度儀（英國馬爾文公司）；JEM-1400 透射電鏡（日本JEOL 電子株式會(huì)社）；JW-2017H 高速離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

10-羥基喜樹堿原料藥（南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY16950402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；10-羥基喜樹堿對照品（南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY16951008）；膽固醇（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，批號：20080518）；卵磷脂［阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：B1925037］；水為蒸餾水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HCPT-LP的制備

采用薄膜分散法：稱取處方量的卵磷脂、膽固醇和HCPT，加三氯甲烷-無水乙醇（體積比1∶1）混合溶液10 mL 使溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL 茄形瓶中，在設(shè)定溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，用PBS 緩沖溶液（pH=5.9）15 mL 水合脫膜30 min，再經(jīng)超聲處理25 min，搖勻，即得HCPT-LP混懸液。

2.2 HCPT-LP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18反相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（體積比65∶35）；檢測波長為384 nm；柱溫為28 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取HCPT 對照品2.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇超聲處理25 min使溶解，定容，制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的HCPT對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取卵磷脂27 mg、膽固醇13.5 mg、羥基喜樹堿1.8 mg，照“2.1”項(xiàng)下的方法操作，制得HCPT-LP混懸液。精密量取HCPT-LP混懸液5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲處理25 min，定容，制得HCPT-LP供試品溶液。

2.2.4 空白脂質(zhì)體樣品溶液的制備 按處方比例稱取卵磷脂27 mg，膽固醇13.5 mg，照“2.1”項(xiàng)下的方法操作，制得空白脂質(zhì)體混懸液。

2.2.5 專屬性考察 取HCPT對照品、HCPT-LP供試品和空白溶液分別注入色譜儀，結(jié)果見圖1?？梢?，目標(biāo)峰具有良好的分離度，空白溶液無干擾。

圖1 專屬性考察色譜圖Figure 1 Chromatograms of specificity investigation

2.2.6 精密度試驗(yàn) HCPT 對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測得峰面積的RSD值為0.78%，表明方法精密度良好。

2.2.7 線性關(guān)系考察[7]將HCPT 對照品溶液配制成質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 mg/mL 的HCPT 對照品溶液，以HCPT 質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=714.17X+0.218 4，r=0.999 8。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一份HCPT 供試品溶液在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果測得峰面積的RSD 值為1.39%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 分別精密量取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的HCPT 對照品溶液、脂質(zhì)體混懸液各3 mL，轉(zhuǎn)移至同一10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，超聲處理25 min 使破乳，平行制備6 份。測得HCPT 的平均回收率為98.19%，RSD 為3.09%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 HCPT-LP包封率測定方法的建立

精密量取HCPT 混懸液6 mL 于離心管中，12 500 r/min 離心30 min，精密吸取上清液4 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲處理15 min，定容，制得HCPT 游離藥物溶液，按“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)樣測定，按下式計(jì)算包封率（EN）[8-9]：

EN=（1-Cf/Ct）×100%，

式中：EN 為HCPT-LP 的包封率；Cf為游離藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Ct為總藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4 單因素考察HCPT-LP制備工藝

2.4.1 藥物質(zhì)量濃度 固定卵磷脂與藥物質(zhì)量比為17∶1、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為2∶1、溫度為35 ℃，將藥物在水合介質(zhì)中的質(zhì)量濃度分別配制為0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL，考察不同濃度的藥物對包封率的影響，結(jié)果見圖2。可見，藥物在水合介質(zhì)中的質(zhì)量濃度在0.08～0.16 mg/mL范圍內(nèi)，包封率變化不明顯。因此，將藥物質(zhì)量濃度固定為0.12 mg/mL。

2.4.2 包封溫度 固定藥物在水合介質(zhì)中的質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、卵磷脂與藥物質(zhì)量比為17∶1、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為2∶1 不變，將溫度分別設(shè)定為30、35、40、45、50 ℃，考察不同溫度對包封率的影響，結(jié)果見圖2。可見，隨著溫度的提高，包封率先升高后下降。

2.4.3 卵磷脂與藥物質(zhì)量比 固定卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為2∶1、溫度為35 ℃、藥物在水合介質(zhì)中的質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL，將卵磷脂與藥物質(zhì)量比分別設(shè)定為11∶1、13∶1、15∶1、17∶1、19∶1，考察卵磷脂與藥物的不同質(zhì)量比對包封率的影響，結(jié)果見圖2?？梢姡幈仍?1∶1～19∶1 范圍內(nèi)，包封率先升高后下降。

2.4.4 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比 固定卵磷脂與藥物質(zhì)量比為17∶1、藥物在水合介質(zhì)中的質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、溫度為35 ℃，將卵磷脂與膽固醇比分別設(shè)定為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，考察卵磷脂與膽固醇的不同比例對包封率的影響，結(jié)果圖2。可見，隨著脂膽比的增大，包封率先升高后下降。

圖2 各個(gè)因素對HCPT-LP包封率的影響Figure 2 Effects of various factors on encapsulation efficiency of HCPT-LP

2.5 Box Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化HCPT-LP工藝

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取對包封率影響較顯著的3個(gè)因素：卵磷脂與藥物質(zhì)量比、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比及包封溫度，采用響應(yīng)面法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表1－3。

表1 因素與水平表Table 1 Factors and levels

2.5.1 數(shù)據(jù)處理 由表3可見，總模型達(dá)到顯著水平（P=0.004 3），模型變異系數(shù)CV 為3.18%，失擬項(xiàng)P值為0.238 0，表明模型擬合情況良好。經(jīng)Design-Expert V8.0.6.1 軟件分析，得二元多元回歸方程：Y=94.16-3.70A+0.47B+2.13C+7.11AB+3.19AC+0.16BC-7.99A2+0.11B2+2.78C2，R2=0.919 8，表明模型擬合較好。

繪制響應(yīng)值包封率與各因素的三維效應(yīng)面圖與二維等高線圖，結(jié)果見圖3。可見，因素A 與因素B 的交互作用，以及因素A 與因素C 的交互作用在三維效應(yīng)面圖上形成角度較大的坡面，表明這兩種因素的交互作用對包封率的影響較大。因素B與因素C 的交互作用形成的面較平緩，表明其對包封率的影響較小。結(jié)合表3數(shù)據(jù)，模型項(xiàng)A 的P值為0.004 3，模型項(xiàng)AB 的P值為0.001 8，模型項(xiàng)A2的P值為0.000 8，3 個(gè)模型項(xiàng)均顯著（P<0.05）。綜上，在薄膜分散法的制備工藝中，卵磷脂與藥物質(zhì)量比對包封率影響最大，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比與包封溫度對包封率的影響次之。

圖3 各因素交互作用對羥基喜樹堿脂質(zhì)體包封率的影響Figure 3 Effects of interaction of various factors on encapsulation efficiency of Hydroxycamptothecin liposomes

表2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 響應(yīng)面模型的回歸方差分析結(jié)果Table 3 The results of regression analysis of variance of response surface model

通過上述三維效應(yīng)面圖以及二維等高線圖，分析效應(yīng)面的較優(yōu)區(qū)域，由軟件分析計(jì)算，得制備HCPT-LP 的最優(yōu)處方為：卵磷脂與藥物質(zhì)量比（A）為14.07∶1；卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比（B）為2.23∶1；包封溫度（C）為48.64 ℃。包封率預(yù)測值為98.29%。2.5.2 最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證 按上述優(yōu)化工藝平行制備3 批HCPT-LP，測得樣品的平均包封率為95.97%，與理論預(yù)測值（98.29%）接近，表明該模型能較好地預(yù)測由于工藝參數(shù)不同而引起的包封率變化。

2.6 HCPT-LP的結(jié)構(gòu)表征

取HCPT-LP 混懸液，用3%磷鎢酸溶液負(fù)染后置透射電鏡下觀察[10]，結(jié)果見圖4。可見，脂質(zhì)體形態(tài)多為球形或類球形，粒徑相對集中在200 nm附近。

另取適量HCPT-LP混懸液，分別置于粒徑及電位樣品池中檢測，得到其粒徑分布圖及電位圖[8]，如圖4所示?？梢?，HCPT 脂質(zhì)體的平均電位為-33.1 mV，平均粒徑為193.1 nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.221，粒徑呈正態(tài)分布于50～900 nm范圍。

圖4 HCPT-LP的透射電鏡圖（A）與粒徑分布圖（B）Figure 4 Transmission electron microscopy (A) and particle size distribution(B)of HCPT-LP

3 討論

響應(yīng)面法常用于制劑處方和工藝的優(yōu)化，主要采用Central Composite Design-響應(yīng)面法（CCD）以及Box Behnken Design-響應(yīng)面法（BBD）2種形式：CCD法適用于多因素多水平實(shí)驗(yàn)，有連續(xù)變量存在；BBD法適用于因素水平較少（一般因素少于5個(gè)，水平少于3 個(gè)）的實(shí)驗(yàn)[8]。本研究曾采用CCD 法優(yōu)化設(shè)計(jì)，但擬合的模型達(dá)不到顯著水平，后嘗試擴(kuò)大因素的水平后重新進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)溫度下脂質(zhì)體難以形成，無法進(jìn)行優(yōu)化。在擴(kuò)大因素范圍的基礎(chǔ)上，改用BBD法優(yōu)化設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明擬合得到的模型可達(dá)到顯著水平，各相關(guān)參數(shù)良好，能較好地預(yù)測HCPT-LP 制備工藝中各因素與包封率指標(biāo)；故采用BBD-響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。

含藥脂質(zhì)體包封率的常用測定方法有透析法、離心法、有機(jī)溶劑萃取法和柱析法等，本課題組前期研究表明，高速離心法具有操作簡便、脂質(zhì)體與藥物羥基喜樹堿分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，故本文采用高速離心法測定包封率。

惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療以靜脈注射化療藥物為主，但常常由于藥物無靶向性導(dǎo)致治療效果不理想，且毒副作用較大。有研究表明，人體正常血管內(nèi)皮間隙一般小于100 nm，而惡性腫瘤處的血管間隙可達(dá)780 nm[11]；當(dāng)納米粒子電荷為陰離子或中性時(shí)，可有效地逃避腎臟排泄，在循環(huán)系統(tǒng)中持續(xù)更長的時(shí)間，且性質(zhì)更加穩(wěn)定[12]。本研究制備的HCPT-LP 的平均粒徑為193.1 nm，從粒徑上來看，此脂質(zhì)體能夠輕松透過惡性腫瘤處的血管間隙，到達(dá)病灶組織而發(fā)揮治療作用，此可能為脂質(zhì)體能夠靶向治療惡性腫瘤的一個(gè)主要原因；Zeta 電位為-33.1 mV，從電位上來看，脂質(zhì)體電位為負(fù)值，在循環(huán)系統(tǒng)中不易被降解，延長作用時(shí)間，在體內(nèi)可被動(dòng)靶向于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的臟器，有利于增強(qiáng)抗腫瘤效果并減輕毒副作用[13]。

綜上，HCPT-LP新制劑的研制，解決了由于HCPT為水不溶、脂難溶性藥物，難以達(dá)到較高包封率的難題，為更多的癌癥患者帶來新的治療希望。